中药成分测定方法.PPTVIP

* 4、检测器 检测器 特点 检测限 适用范围 紫外检测器（UV或UVD）分为:①可变波长型②二极管阵列检测器 ①用于检测有外吸收的物质; ②灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱. 10-7-10-12g 用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧基化合物等 荧光检测器(FD) ①用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质; ②灵敏度高于紫外检测器 1×10-10g/ml 主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等 蒸发光散射检测器(ELSD) ①属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相的任何样品组分; ②检测灵敏度较低,适用于流动相能挥发的色谱洗脱,不能用含缓冲盐的流动相 用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物 * 4、检测器 电化学检测器(ECD) 用于能氧化、还原的有机物质的检测 1×10-12g/ml 适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等 示差折光检测器(RID) ①属通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测. ②稳定性好,操作方便.③灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动的影响大,不适合梯度洗脱 10-8g/ml 尤其适合于糖类的检测 化学发光检测器(CLD) ①高选择性、高灵敏度的新型检测器. ②设备简单,自身发光,无需光源,价格便宜 Pg级(10-12) 用于分析微量脂质、核酸、生物胺等 * 5、HPLC前处理 （1）流动相的处理 ①溶剂的纯化 选择专供色谱分析用的“色谱纯”溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析的要求。由于不同的色谱柱和检测方法对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统二次蒸馏水。 第三节 常用定量分析方法 * ②流动相脱气 HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气，习称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气，常用的脱气法有超声波振荡脱气、惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热法。 ③过滤 过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，采用0.45μm以下微孔滤膜过滤。 滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。 第三节 常用定量分析方法 * 第三节 常用定量分析方法 （2）样品的处理 HPLC分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符合HPLC的要求。 ①待测组分的提取 ②溶剂的挥发(浓缩） ③滤过 样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。 * 第三节 常用定量分析方法 正相色谱:流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，主要用于极性物质的分离测定； 反相色谱:流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的分离测定 * 第三节 常用定量分析方法 1、薄层吸收扫描法 基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。 光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达ng级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。 * 2、薄层荧光扫描法 基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中F与C 进行运算。 第三节 常用定量分析方法 * （二）薄层色谱的规范化操作 1、仪器与材料 ①薄层板；②涂布器；③点样器材；④展开箱（层析缸）⑤显色与检测仪器 2、操作方法 ①薄层板的制备；②点样；③展开；④检测； 第三节 常用定量分析方法 * 第三节 常用定量分析方法 （三）定量分析方法 1、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法