HE染色(石蜡切片).pptVIP

HE染色(石蜡切片) 一．取材与组织的固定 二．组织固定后处理及石蜡切片 三．HE染色 1.取材的注意事项 2.组织固定 （1）材料保持新鲜：尽量在动物死后半小时内处理完毕，投入固定液。 （2）组织块避免挤压：用手术刀切取组织块时切割时避免来回锉动。取材时，组织块可取稍大一点，以便在固定后，再将组织块的挤压或损伤部位修去。 （3）选取好组织块切面：确定是做横切还是纵切。 （4）保持材料清洁：可用生理盐水冲洗组织块，然后再浸入固定液。 常用10%的福尔马林（甲醛）， 或者自配FAA溶液(10%甲醛10ml，冰醋酸5ml和95%乙醇85 ml)。做光镜观察的组织块选好切面，尽快浸入固定液中，使其迅速凝固，防止自溶和腐蚀，使其尽可能地保持与生活状态相似的结构，有利于切片和观察，这就是组织固定的目的。固定时间的长短视固定剂的种类、气温、组织块的大小而定，如果固定时间较长，要定期换固定液（一周左右换一次）。一般放在室温或4摄氏度的环境下保存，绝对不可冷冻结冰。 1.组织修整 :在固定结束后，应对组织块进行修整，将受挤压或不需要的部分组织进行修切，同时选在好包埋面。 2.组织脱水 3.组织透明 4.组织浸蜡 5.组织包埋 6.组织切片 7.摊片、贴附、烤片 :摊片时水温一般控制在35°~40°左右；一般把切片贴附在载玻片2/3交界处；烤片时温度要适宜，高温短时，低温长时。 组织经固定后含有许多水，由于水跟石蜡不能互相溶解，因此不能直接进行石蜡包埋，还需经过脱水这一过程，逐步用某些试剂将组织中的水分置换出来。 常用的脱水剂是酒精，脱水的目的是将固定了的组织内的水分去除，以便使切片时的支撑物石蜡充分进入组织内（水跟石蜡不能相互溶解）。为避免脱水过程中组织收缩，必须用逐级升高浓度的酒精依次浸泡脱水：60%（2h）→75%（过夜）→85%（过夜）→95%（2h）→无水酒精（1h）。如果中途因故不能继续下去，则可将组织退回到75%~85%酒精中保存，无水酒精中不要超过4个小时。具体的脱水时间要根据组织块大小、厚度以及脱水剂的新旧程度等情况。（具体时间自己摸索） 透明的目的是将与石蜡结合的媒介剂（二甲苯）浸入组织，并将不能与石蜡结合的脱水剂（酒精）置换出来，为了更好的浸蜡和包埋，并使组织透明。常用的透明剂是二甲苯，二甲苯透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，小块组织以30min为宜，较大的组织块可适当延长，但不能超过2h。 为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精之后，先经过酒精二甲苯的混合液，然后再浸入二甲苯中。无水酒精：二甲苯=1：1，15min一次；二甲苯，15min两次。（具体时间自己摸索） 浸蜡是指透明过的组织块在融化的石蜡中浸渍的过程，其目的是使组织内有一定的支撑物，组织与石蜡成为不可分离的整体，使之具备一定的硬度和韧度，便于切出满意的切片。（常用石蜡的熔点为60~62摄氏度，如果做免疫组化，为了保存组织内的抗原，可用48~50摄氏度的低熔点石蜡）。 一般要浸蜡3次，第一次时间30min，第二次时间2h(或者过夜) ，第三次1-2h(具体时间自己摸索) 将浸蜡彻底的组织用石蜡包埋成规整的长方形块状物体，便于在切片机上切片。包埋时应注意包埋面，包埋好的组织块进行修整，把整块的组织面修出来。注意往模中倒蜡包埋时，浸蜡的组织块尽量在熔化状态，从而使蜡跟浸蜡的组织块形成一个整体。 将石蜡包埋块置于切片机切片，厚度5um。经过修整的石蜡包埋块，在切片之前进行冷冻（0~-10摄氏度），在夏季高温的情况下冷冻时间相对要长。在切片过程中，组织面完全暴露，整张切片必须完整，切片刀要锋利，切片机各螺丝要旋紧（不切片时切片机要关上保险，防止被刀片割伤）。 苏木精是一种碱性染料，将嗜碱性的细胞核和细胞内的核糖体染成蓝紫色；伊红是一种酸性染料，将嗜酸性的细胞质染成红色或淡红色。在HE染色中，细胞核的染色至关重要。 （1）脱蜡：染色前，必须将石蜡切片中的石蜡去除，否则水溶性染料不能与组织结合，这一步称为脱蜡。脱蜡程序与脱水包埋恰好相反，先将切片置于二甲苯中使石蜡溶解（5~10分钟），再由高到低的酒精水化：无水酒精→95%→85%→70%（各级2~5分钟），然后经蒸馏水转入染缸。 （2）苏木精染色：苏木精染色5~20分钟，水洗载玻片上多余染液，0.5%~1%盐酸酒精分色片刻。镜检，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒。然后流水冲洗15~30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。蒸馏水短洗