报告基因系统的研究进展cropped.docVIP

综述·其它专题综述·报告基因系统的研究进展沙新平 Ξ 综述 胡国龄 审校(中南大学湘雅医院传染病研究所 综 述 ·其它专题综述· 报告基因系统的研究进展 沙新平 Ξ 综述 胡国龄 审校 (中南大学湘雅医院传染病研究所 ,长沙 410008) 摘 要 :综述氯霉素转乙酰酶 ( CA T) 、β2半乳糖苷酶 (β2gal) 、β2葡萄糖苷酸酶 (p2GU S) 、分泌型碱性磷酸酶 ( SEA P) 、荧光素酶 (luc) 、绿荧光蛋白 ( GF P) 等报告基因系统研究与应用进展 ;简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和 优缺点 。 关键词 :氯霉素转乙酰酶报告基因 β; 2半乳糖苷酶报告基因 ;分泌型碱性磷酸酶报告基因 ; 绿荧光蛋白报告基因 ; 荧光素酶报 告基因 中图分类号 : Q756 文献标识码 :A 文章编号 :100623730 (2003) 0120026203 法用于报告基因的测定如 : 比色法 (colorimet ry) 、荧光法 (fluo2 rescent) 、生物发光法 ( bioluminescent) 、化学发光法 ( chemilumi2 nescent) 、酶联免疫法 ( EL ISA) 及原位染色法 (in sit u staining) 及 流式细胞仪法3 。 2 报告基因的种类 2 . 1 氯霉素转乙酰酶报告 基 因 ( chlormnp henicol acetylt rans2 ferase ,CA T) 细菌的 CA T 酶能将乙酰基从乙酰辅酶 A 转移 到氯霉素上 ,而使其失去抗菌性 。该反应能通过测量放射性标 记的底物而量化 。放射性同位素标记底物有3 H 标记的乙酰辅 酶 A 和14 C 标记的氯霉素或荧光素标记的其中之一 。CA T 抗 体因可以用于 EL ISA 法检测 CA T ,所以也广泛用于该反应的 检测 ,虽然 CA T 的测定只能用细胞提取物进行 ,且测定的范围 很窄 ,且可能有放射性同位素的污染 ,而限制了它的应用 ,但由 于它在真核细胞中的本底很低 ,结果的重现性很好及灵敏度很 高 ,而在进行表达的改变的研究中仍广泛应用 。目前有很多著 名公 司 生 产 有 CA T 分 析 系 统 的 商 品 试 剂 盒 。如 Amersham Pharmacia Biotech 公司曾经生产 (2002 年的产品目录上已经不 存在了 !) 的 Quan2T2CA TTM Assay System ,该试剂盒检测3 H 标 记的乙酰辅酶 A 和生物素标记的氯霉素 ,使用者只需用试剂 盒提供的链亲和素包被的聚苯乙烯株俘获氯霉素 ,再通过液闪 法测定放射性计数 ,即可计算出 CA T 活性 。据称 ,该方法的灵 敏度是14 C 为底物方法的 30 倍 。作为改进 St ratagene 公司的 Pat hDetect t rans2reporting systems 试剂盒可有多种报告基因选 择 ,如 CA T , hr2GF P , SEA P 等 ,且提供一种高转染率的受体细 胞 ,最大的优点是能进行反式转录因子的测定 ,且灵敏度高 、本 底小及检测方法简单 。Pro mega 公司也生产有 p CA T ? 3 全套 试剂盒 ,与该公司既往生产的同类载体相比 ,适当改变了多克 隆酶切位点 ,使其更加易于插入目的片段 。另外 ,该试剂盒的 CA T 分析法 ,有放射性同位素标记和荧光素标记两种选择方 法 。 在研究基因功能的过程中 ,不可避免地要研究基因的调控 机制 ,基因的表达产物非常复杂而难以对其定量和定性 。要在 细胞的生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常 困难 。但研究者发现了一种简单的研究基因调控的方法1 即 报告基因分析系统 。报告基因分析系统的发现给基因的调控 与表达的研究带来了新的希望 ,短短的几年 ,报告基因系统的 研究也取得了快速的发展 ,本文将对报告基因的研究进展做一 综述 。 1 报告基因的研究背景 对真核基因的调控的了解 ,主要来自野生型和突变型的假 定顺式作用调控元件的活性测定实验 ,这些实验是在转染的真 核细胞中进行的 。转录的起始点 ,可以通过对 mRNA5′端在模 板 DNA 中的确切位置进行作图来决定 , 这些技术包括 : 引物 延伸 分 析 、DNA : RNA 杂 交 体 的 S1 核 酸 酶 消 化 以 及 RNA : RNA 杂交体的 RNA 酶 A 消化等 。但直接测定 RNA 的丰度及 结构 ,有一个大的问题 : 由于需要纯化并通过杂交和电泳来分 析各种不同的 RNA ,将是一个很大的工程 。因此 ,在大多数情 况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能