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激光共聚焦显微镜的使用和管理 lj{l跚—.. 激光共聚焦显微镜的使用和管理 王炜 (广东医学院分析中心广东东莞523808) 工业技术 摘要:阐述了LEICATCSSP5共聚焦显微镜的组成,工作原理样品削备方法,提出了该激光扫描共聚焦显微镜的日常维护和管理方法. 关键词:共聚焦显微镜使用管理 中图分类号:TN16文献标识码:A文章编号:1672-3791(2011)07(c)--0116--01 激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanning ConfocalMicroscope,LSCM)是随着计算机 技术和光电技术的飞跃发展,在20世纪80 年代后期发展起来的.在生命科学研发中, LSCM技术已经成为生物医学中一个标准 的研究工具.目前共聚焦显微镜的功能非 常多,好像是一个科研工作站,其应用也大 多在生命科学研究领域.围作为大型贵重 精密仪器,LSCM的日常使用的管理需要按 照严格的规程来实施,LEICATCSSP5共 聚焦显微镜的使用及管理方法如下. 1了解仪器的组成 所有上机操作的人员必须经过培训, 了解仪器组成,工作原理和操作规范方可 上机. 1.1仪器的组成 LEICATCSSP5主要由四部分组成:(1) 显微镜光学系统.为倒置显微镜;镜头包括 共聚焦专用平场复消色差10X,20×,40X, 63(油镜),100X(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3) 激光光源.本机器包含4个激光器:405nm激 光,氩离子激光(457,476,488和514nm), 56lnm激光,氦氖633nm激光,共四个检测 通道;(4)检测系统.整套仪器由计算机控 制,各部件之间的操作切换都可在计算机 操作平台界面中方便灵活进行.由于激光 器在工作时散发大量的热,需要风扇降温, 突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配 备稳压电源和不间断供电装备. 1.2工作原理 LSCM的工作原理是:照明针孔与探测 针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光 源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并 聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一 点进行扫描.然后,激发出的荧光经原来入 射光路直接反向回到分光镜,通过探测针 孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管 (PMT)探测收集,并将信号输送到计算机, 在这光路中,焦平面以外区域射来的光线 在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔, 只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被 观测到. 2清楚机器操作基本步骤 (1)打开稳压电源. (2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜, 扫描器,激光电源开关,将激光开关钥匙顺 时针旋转9O.至On—l位置.(各按钮间隔 时间15s以上). (3)打开显微镜电源及荧光电源. (4)启动徕卡共聚焦软件LASAF. (5)选择合适的物镜,视野. (6)TL/IL功能键在明视场和荧光之 间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合 适的荧光滤块,进行样品的荧光观察. (7)工具栏下方Configurationgt;Laser,根 据染料的激发波长,选择所需激光. (8)点击Aquire进行光路设置,可改变 所选激光,调节激光输出功率,改变分光 镜,改变所选PMT,调节PMT检测范围,调 节PMT的gain或offset. (9)单击AdditionalChannels以显示 透射光检测器(PMTTrans),选择观察方 法(BF,DIC等). (1o)在Acquire菜单栏的Acquisition 中选择扫描模式(AcquisitionMode),默认 模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用 于xy扫描和z轴层切(xyz扫描).还可按样品 扫描需要在下拉菜单中选择由X,Y,z,t(时 间)以及(波长)组合而成的多维扫描模式, ~Nxzy,xyt,xy,xyzt,xyz入,xyzt等. (11)在Acquire菜单栏的Acquisition 中设置扫描参数,包括分辨率,扫描速度, 针孔大小,线平均,面平均,累加及放大倍 数等. (12)预览图像并优化参数.点击Live 以设定的扫描参数预览图像,图像将显示 在右侧的显示屏上.调节Z轴位置找到最适 合观察的焦平面,并调节PMT的电压及偏 移,或激光输出功率使图像达到最佳.可通 过控制面板上相应旋钮调节以上参数.需 注意参数对图像质量的正面和负面影响. (13)采集图像并保存.单击Capture Image采集图像,注意:从获取第一张图片 后就要开始保存,以后每获取一张图片都 要保存一次,以免数据丢失. (14)关闭显微镜汞灯电源.若使用过油 镜,需用清洁液或无水乙醇清洁镜头. (15)关闭LASAF软件,将激光开关钥 匙逆时针旋转9O.至On-0位置,依次关闭 扫描器电源,电脑,显微镜电源. (16)风扇停止后(关闭激光开关钥匙约 15min后),关闭激光电源按钮.