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黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应 化学研究与应用 ChemicalResearchandApplieafion vo1.16.No.4 Aug.,2OO4 文章编号:1004—1656(2004)04—0482—03 黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应 刘鑫,李佳,刘克武,黄新河,赵巍 (四川大学生命科学学院,四川成都610O64) 摘要:从麸醋母曲中分离出黑曲霉Asp5609并以此为诱变出发菌株,采用紫外线照射结合亚硝基胍诱变剂处 理,筛选出酸性蛋白酶高产变异株Asp5609.7.用盐溶加温提取法从Asp5609-7固体发酵物料中提取酸性蛋 白酶粗酶液,经DC.30型中空纤维柱超滤浓缩,用于食醋酿造物料蛋白的酶解催化,可大幅度提高醋液中氨基 酸含量. 关键词:黑曲霉;酸性蛋白酶;食醋酿造;催化效应 中图分类号:0643.3文献标识码:A 蒸酒酿醋在我国至少已有4OOO多年的历史. 镇江香醋,山西陈醋,四川阆州醋,被举为当今几 大名醋.多年来在消费者的生活中食醋通常仅作 调味使用.随着人民生活水平的提高,消费者期 望食醋除具备调味功能之外,还应赋予营养保健 作用[1l. 食醋酿造包括酒精发酵,醋酸发酵,后期成熟 发酵三个时期.在第三发酵期加入由黑曲霉制备 的酸性蛋白酶,有利于催化发酵物料中蛋白质的 进一步水解,增加醋液中氨基酸含量,提高其营养 价值. 1实验部分 1.1材料与仪器 菌种来源:以本项目组从四川阆州优质麸醋 的醋母中分离筛选出黑曲霉菌株(Asperiilus?niger 5609,Asp5609)为诱变出发菌株. 斜面培养基:察氏培养基;分离培养基:在察 氏培养基中加入0.8%的酪蛋白;固体发酵基础 培养基;每100g麸皮中加水40mL,添加NH4Cl 1.5%,pH_5.5,分装于500mL三角瓶中;液体发酵 培养基(%):豆饼粉4.0,玉米粉0.8,鱼粉0.8, Nit4CA1.0,CaCh0.05,K2HPO40.1,豆饼水解液 6.0,pH5.5. 以上培养基的灭菌条件均为121oC,30rnin. 紫外灯(输出电压210V,功率15W);pH计 (pSH一3B);紫外可见分光光度计(Uv一752C,上海 第三分析仪器厂);超净工作台(SW—CJ—IF,苏州安 泰空气技术有限公司);生化培养箱. 1.2菌株的诱变处理 紫外线诱变处理:用接种环取新鲜PDA斜面 上的黑曲霉孢子少许,加入无菌水中进行稀释,用 血球计数板进行计数,使每毫升溶液中孢子量约 为5000个,取0.1mL涂布初筛平板.30℃恒温 培养4h,让孢子萌发,然后用15w紫外灯照射8 rain后(紫外灯与平板垂直距离30em),在黑暗的 培养箱中继续培养3d,挑取透明圈大的菌落用作 亚硝基胍诱变处理菌株. 亚硝基胍诱变处理:用接种环取新鲜PDA斜 面上经紫外线诱变处理的黑曲霉孢子少许,加入 无菌水中进行稀释,用血球计数板计数,使每毫升 溶液中孢子量约为5000个,取3mL孢子悬液,加 入等体积的亚硝基胍溶液(3m#mL),充分混合, 于30℃振荡处理1h,取出稀释涂平板,30℃培养 3d,挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验.选 育出黑曲霉Asp5609—7变异株. 1.3黑曲霉Asp5609—7固体发酵条件 培养时间60h,前30h30oC,后30h25oC变 温培养,培养基pH5.0,培养基持水量50%左右, 接种量8%. 1.4酸性蛋白酶活性测定 用Folin法测定【3J,规定在pH3.0,温度47℃ 条件下,每分钟水解酪蛋白产生1/zg酪氨酸所需 的酶量为1个蛋白酶活性单位. Asp5609—7酸性蛋白酶提取工艺如下: 固体发酵捣碎浸提塑压滤 墅堕苎塑月且中空纤维柱浓缩—一浓缩液体酶制剂 图1工艺流程图 Fig.1ChartProcessFlow 收稿日期1200402—16;修回日期:2004-O4-15 联系人简介:刘克武(1952一),男,副教授,主要研究生物化学与分子生物学.E-mail:liukewuseu@yahoo.coin.en 第4期刘鑫等:黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应483 1.5Asp5609-7在食醋酿造中的催化效应 将Asp5609—7酸性蛋白酶液体酶按5.0% (v/w)的比例加至固体发酵4o天的食醋发酵料 中.60天时测定发酵醋液中氨基酸组成,含量及 鲜味氨基酸含量(Glu+Asp)和还原糖含量,并与 对照比较所产醋液的色泽,品味. 2结果与讨论 2.1黑曲霉Asp5609诱变结果 用紫外灯照射后的菌株涂布平板进行初筛, 共挑取6o株;经液体发酵培养基摇瓶复筛得到产 酶高的菌株l0株,此lO株再经过固体发酵复筛, 其中三株产酶活性较高,其酶活力单位如表1所 示.可见,经紫外线照射后酶活最高的