一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选.docVIP

一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选 一 440一江苏农业科学2010年第5期 郑法新,程璐,李侠,等.一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选[J].江苏农业科学,2olo(5):440—443 一 株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选 郑法新,程璐,李侠,王锋 (日照职业技术学院,山东日照276826) 摘要:紫杉醇是临床上所用的非常重要的天然抗癌药物.从云南丽江塔城地区分离的云南红豆杉中采用无菌技 术分离得到110株内生真菌,经过PDA液体培养基发酵后用TLC,紫外分光光度法,HPLC,质谱等方法检测,发现其中 有1株的胞外分泌物中含有紫杉醇,标记为G7一B1.经过形态学鉴别,属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.),紫杉醇 产率为360.75g/L.该种菌具有进一步研究的价值. 关键词:云南红豆杉;内生真菌;紫杉醇;分离;筛选 中图分类号:Q939.1l文献标志码:A文章编号:1002—1302(2010)05—0440—04 紫杉烷类化合物是从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属 (Taxus)植物中分离得到的二萜类化合物的总称,其中以抗癌 新药——紫杉醇最为引人注目.红豆杉是我国珍稀濒危植 物,现在的紫杉醇主要是从其树皮中提取.自1992年美国 FDA正式批准紫杉醇用于治疗晚期癌症以来,过度砍伐红豆 杉现象日益严重.紫杉醇在红豆杉中含量很低,红豆杉资源 又有限,而工业提取紫杉醇存在着严重的资源浪费现象. 内生真菌作为新的用于生物控制的生物活性物质来源已 经越来越引起科学家的重视.Stierle等首次报道了从太平 洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌,为人们提供 了一个可能生产紫杉醇的新途径,从此国际上兴起了内生真 菌产紫杉醇研究的高潮.紫杉醇产生菌种十分多样, Strobel等从西藏红豆杉枝条上分离到一株小孢拟盘多毛 孢;周东坡等从东北红豆杉的树皮中分离筛选出一株树状 多节孢;邱德有等从云南红豆杉(Taxus),MnnⅡm如)中分离 了一株能产紫杉醇的内生真菌,但是产率很低l_j. 微生物发酵生产紫杉醇具有真菌生长迅速,易于培养,所 用培养基成本相对较低等许多优点.可以通过优化发酵条 件,利用生物技术改良菌种,大幅度提高紫杉醇产量,满足市 场需求,可在降低紫杉醇价格的同时减少资源浪费. 1材料与方法 1.1材料 红豆杉树皮和枝条于2008年9月初采自生长在云南丽 江塔城地区的云南红豆杉. 1.2试剂 紫杉醇标准品购于Sigma公司,链霉素购自山东省日照 市结核病防治研究所,甲醇(色谱纯)购自上海国药公司,其 余试剂如乙酸乙酯,三氯甲烷等各种试剂均为国产分析纯. 1.3培养基 固体培养基选用PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖 2Og,琼脂粉5g,蒸馏水1000mL,pH值自然;121℃灭菌 收稿13期:2010—07—28 基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金(编号:2007BS02010). 作者简介:郑法新(1975一),男,山东即墨人,博士,讲师,从事微生物 生物技术研究.E—mail:faxinzheng@163.COITI. 20min,冷却至50—6O℃加入25mg/L链霉素.液体培养基 选用PDA培养基不加琼脂. 1.4内生真菌分离及空白试验 将云南红豆杉的树皮和枝条切成约1.5cm的小段,分别 经75%乙醇消毒10min和0.1%HgCI溶液处理15min,然 后用无菌水冲洗,接种于含链霉素的PDA固体培养基平皿 上,置于27℃恒温箱中培养,待长出菌落后,按无菌操作程序 挑出,在PDA斜面培养基上纯化3次以上,将纯化后保存在 PDA斜面培养基上的菌株放人冰箱中4℃保存备用. 对照试验:把空白平板打开,摆在超净台上10min,将上 述同样表面消毒过的材料不做任何切割,直接种植于PDA平 皿上,相同条件下培养. 1.5菌种鉴定 从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成 玻片,置于光学显微镜下观察菌丝形态,孢子梗形态,孢子形 态以及孢子与营养体之间的着生关系,查阅有关资料确定真 菌的分类学地位”. 1.6提取产物的检测 1.6.1菌株的发酵培养将分离纯化后得到的真菌菌株进 行摇床液体扩大培养,用制备的无菌PDA液体培养基将真菌 菌丝体和孢子洗下接人250mL三角瓶,27℃200r/rain培养 3d作种子培养基.种子培养基再接人lL摇瓶扩大培养 12d,每种菌保证初始液体培养基为1L. 1.6.2发酵产物的萃取把菌体发酵液反复冻融2次,过滤 发酵液得滤液上清液,旋转蒸发上清液约剩余1/10,大约剩 20～25mL上清.倒入等体积的乙酸乙酯,搅拌混匀,用膜封 口,冰箱中4℃萃取12h,分离有机相,萃取2次,收集有机 相.有机相35℃下减压浓缩,除去有机相后加5mL甲醇 (