乳鼠原代心肌细胞培养方法与技巧.docVIP

热磁 力 搅 拌 器 搅 拌 预 热 热磁 力 搅 拌 器 搅 拌 预 热 到 37 ℃ (搅 拌 速 度 60～ 100 r /m in) ,消化 8 m in; 弃上清液 ,再次加入胰酶继 续消化剩余组织 ,重复消化直至碎片几乎完全消化 ; 分别收集各次消化后的上层细胞 悬液 置 于冰 上 , 经 200目不锈钢网过滤以去除未消化的组织及细胞团 , 并马 上 加 等 量 的 10 % 血 清 培 养 液 以 终 止 反 应 , 1 500 r /m in离心 8 m in; 弃上清液 ,加入 1 mL 血清培 养液 , 吹 散 沉 淀 细 胞 , 再 次 离 心 ( 1 500 r /m in 离 心 8 m in) ;弃 上 清 液 , 用 10 %血 清 培 养 液 制 成 细 胞 悬 液 ,按差速贴壁分离法纯化心肌细胞 ,以 5 ×105 个 /L 接种于 培养 瓶中 , 置 37 ℃、5 % CO2 培 养 箱 中 培 养 1. 5 h;此后每 2 d换液 1次 ;加入终浓度为 0. 1 mmo l /L 5 - 溴脱氧核苷以抑制成纤维细胞的增殖 。 1. 4 形态学观察 生长第 3天在倒置相差显微镜下观察心肌细胞 的形态学变化并摄像 。 1. 5 心肌细胞的鉴定 心肌细胞免疫组化鉴定一般采用的蛋白是 α - 横纹肌肌动蛋白 。α - 横纹肌肌动蛋白仅存在于心 肌细胞和骨骼肌细胞中 , 在心肌 中不 存在 骨 骼肌 细 胞 ,因此笔者采用链霉亲和素 - 生物素 - 过氧化物酶 ( SABC )免疫细胞化学法检测横纹肌肌动蛋白的 表 达来鉴定心肌细胞 。 2 结果 2. 1 原代培养的心肌细胞形态学观察 在倒置相差显微镜下观察发现 ,刚接种的心肌细 胞悬浮于培养 液中 。培 养 3 h 后 , 心 肌 细 胞 逐 渐 贴 壁 ,呈圆形 ;培养 12 h后 ,心肌细胞已贴壁生长 ,呈三 角形或扁平形 ,偶有自发性搏动 ,搏动频率较慢 ,有的 每分钟仅数次 。培养 24 h后 ,细胞已全部贴壁 ,贴壁 后呈梭形 、三角形或不规则多边形 (见图 1 a ) ; 胞核 小 ,圆而致密并居中 ;胞质颜色较深 ,核周胞浆可见颗 粒样物质 ; 90 %开始搏动 。培养 48 h后 ,细胞逐渐在 皿底表面铺展 ,并伸出伪足 ,形成不规则的星形并相 互接触交织成网 (见图 1 b) ,出现自发搏动 ;培养 72 h 后 ,心肌细胞融合成片形成单细胞层 (见图 1 c ) ,局部 细胞生长密集处可形成呈放射状排列的细胞簇 ,同簇 细胞搏动同步化 (见图 1 d) ,每分钟 120次左右 。 2. 2 心肌细胞横纹肌肌动蛋白的免疫细胞化学染色 细胞培养技术现已广泛应用于生物学和医学研 究领域 。心肌细胞培养作为一种体外试验研究模型 , 可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的 发病机制 。体外培养的心肌细胞作为多种细胞病理 模型广泛应用于生理 、病理和药理研究 [ 1 - 2 ] ,其最主 要的优点是具有自发搏动性 ,可以不受神经 、体液因 素条件下各种药物对活细胞的影响 ,并且可以节约动 物及药品 ,从而提高效率 。分离培养出高纯度的心肌 细胞是对心脏相关疾病进行各种研究的前提和基础 。 虽然心肌细胞的培养方法已早有报道 , 但均存在细 胞存活率低 、纯度不高等诸多缺陷 ,如何使心肌细胞 培养的方法更为简单 ,并且使分离的心肌细胞达到理 想的存活率和纯度 ,是体外培养心肌细胞模型的关键 问题 。为此笔者在多年新生大鼠心肌细胞培养的经 验和方法的基础上加以改进 ,获得了简单并且稳定 、 可靠的心肌细胞培养的方法 ,现报道如下 。 1 材料与方法 1. 1 试验动物 SPF级 1～3 日龄 SD 大鼠 ,河北北方学院实验动 物中心提供 ,雌雄不拘 。 1. 2 试剂 胰蛋白酶和胶原酶 ,美国 Sigm a - a ld rich 公司产 品 ;胎牛血清 ,杭州四季青生物工程材料有限公司产 品 ; DM EM 干粉培养基 ,美国 Gibco公司产品 。 1. 3 培养方法 取 1～3 日龄 SD 大鼠乳鼠 10 只 ,用大头针将乳 鼠的头和四肢固定 ,用 75 %酒精棉球消毒胸 、腹部皮 肤 ;剪开皮肤 ,暴露皮下组织 ,更换手术器械 ,在大鼠 剑突处横剪 ,于剑突处正中线稍偏左处向上剪 ,成倒 T型 ,在心脏跳动下用眼科镊迅速夹取心脏放入盛有 用冰预冷的 PB S 液体的平皿中 ; 洗去血凝块和红细 胞 ,用眼科镊将心脏包膜和附着的血管分离干净 ,剪 去心房组织 ,取心室肌放入青霉素瓶 ,洗去残血后将 心室肌剪成碎块 (约 1 mm3 ) ; 用 PB S再次清洗血