课题3-血红蛋白的提取和分离(s).pptVIP

(一）蛋白质 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物 2、组成元素 C、H、O、N 一、基础知识 1、含量 3、相对分子质量 高分子化合物 4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 R H C COOH NH2 6、氨基酸连接方式 脱水缩合 8、分子结构 7、肽键 CO NH 氨基酸 肽链 蛋白质 脱水缩合 盘曲折叠 （一条或者多条） 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是生命活动的主要承担者 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 9、蛋白质结构的多样性 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 思考： ①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个 ②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n - m个肽键,脱去个n - m个水分子，至有氨基和 羧基各m个 11、相关计算 ③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构 ④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n ·a - (n - m) ·18 1、分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、 蛋白质分离的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质 (二）蛋白质的分离 （三）蛋白质分离的方法——凝胶色谱法 ②实例：葡聚糖、琼脂糖 3、凝胶 1、别名：分配色谱法 ①性质：一些微小多孔的球体，大多由多糖类化合物构成 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离 分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱柱的时候，怎样分离？ 思考： 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动较慢； 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动较快，从而分离。 （四）蛋白质分离的方法——电泳 概念：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 原理：样品中各种分子带电性质、分子大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度， 常用的电泳方法： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （五）缓冲溶液 概念： 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 思考：正常情况下，为什么人体的血液的pH能维持在7.35—7.45之间？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) 阅读课本P 67-69的基础上，思考下列问题： 1.蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现在那些实验操作中？ 2. 血红蛋白有何特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 3.如何判断血红蛋白分离是否成功？ 4.填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气泡？ 二、实验操作 【Ⅰ样品的处理、Ⅱ粗分离、Ⅲ纯化、Ⅳ纯度鉴定】 Ⅰ 1.红细胞洗涤：（目的、低速短时离心、重复洗涤） Ⅰ 2.血红蛋白的释放：（蒸馏水、甲苯作用） Ⅰ 3.分离血红蛋白溶液：（分四层） Ⅱ 4.透析：（目的） Ⅲ 5.凝胶色谱操作：（制作、填装、样品的加入洗脱） Ⅳ 6.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳：（测定纯度） 1.蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现在那些实验操作中？ 因含有血色素而呈红色，在样品洗脱时，可通过颜色来判断什么时候收集洗脱液，使操作变得直观、简化了操作步骤。 2. 血红蛋白有何特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 3.如何判断血红蛋白分离是否成功？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 若填装不紧密、不均匀，有气泡，会形成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液中蛋白质的