细胞工程--C3-细胞培养的基本方法.pptVIP

3.3 细胞培养中常用的染色方法 3.3.1 活体染色 3.3.2 染料排除检测法 1. 台盼蓝排除检测法 2. 溴化乙锭和碘化丙啶排除检测法 细胞活性检查方法 1. 配制染色液 2. 制备细胞悬液 3. 染色 细胞活性检查方法 3. 染色 3.1. 0.05%苯胺黑法：使用时，苯胺黑液与细胞悬液以1:10混合，稍放置后制片镜检，死细胞染成黑色，活细胞不着色。 3.2. 0.4%台盼蓝法：取少量细胞悬液，按1：1量加入0.4%台盼蓝溶液，充分混匀，静置1~2 min。制片镜检，活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞的百分比表示细胞活力。 3.3. 0.1%结晶紫法：将细胞悬液与结晶紫液等量混合后，立即制片镜检，着紫色的为活细胞。 细胞活性检查实验注意事项 1. 细胞活性检查是细胞培养的基本技术，它是了解不同药物处理以及生化物质处理等效果的 直观简便手段，也是评定细胞冷冻效果的方法之一。在细胞冻存和复苏过程中，由于遭受非生理性的低温打击等，不可避免地会对细胞产生影响，引起部分细胞活力下降或死亡，通过细胞活性检查可快速检验细胞冷冻效果，是衡量细胞冻存、复苏效果的一种简便易行的方法。 2. 如检查贴壁的细胞时，应先将细胞消化后进行操作。 培养细胞常规检查内容和方法 细胞一经培养，就需随时进行观察。一般应每日观察1次，及时记录细胞的生长状态，在条件允许的情况下最好通过照相来记录细胞的生长情况。发现异常情况要采取相应措施进行处理。细胞常规检察主要包括检查培养液的变化、细胞生长情况、细胞形态及有无微生物污染等。 1. 培养液 2. 细胞生长情况 3. 细胞形态变化 4. 微生物污染 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 将细胞培养瓶从培养箱中取出，用肉眼直接观察。重点观察培养液的颜色和透明度的变化。培养液正常时为清亮透明，出现浑浊则多为污染（悬浮细胞培养除外）。一般培养液中均含有酚红作为指示成分，以此来显示培养液的pH。正常新鲜的培养液为桃红色，这种颜色代表培养液的pH为7.2~7.4。加入细胞培养后由于细胞代谢产生酸性产物，使培养液pH下降而使颜色变浅变黄。一旦发现培养液变黄，则说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，需换液或传代处理。 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 一般正常情况下生长稳定的细胞需2~3 d换液1次，生长慢的细胞需3~4 d换液1次。目前细胞培养多采用CO2培养箱，这样可以使pH相对稳定，利于细胞生长。传代和换液后，如果发现培养液很快变黄，可能由以下因素造成：有细菌污染发生；培养器皿没有洗干净，有残留物；细胞接种数量较大。 2. 细胞生长情况 3. 细胞形态变化 4. 微生物污染 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 2. 细胞生长情况 用倒置显微镜观察。新接种于培养瓶的细胞，绝大多数并不马上开始增殖，均要经历一般适应期或潜伏期，其时间长短不同。原代培养潜伏期较长，从几天到数周不等；细胞系细胞一般时间很短，多为24 h以内；一般胚胎组织或幼体细胞生长的潜伏期较短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3~4 d便可连接成片；而成年组织细胞和部分癌组织潜伏期较长，可达一周左右。 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 2. 细胞生长情况 原代培养中最小可见从组织边缘“长出”细胞，这些细胞通常并不是增殖产物而是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。因而原代早期较少见到分裂细胞。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，生长速度快，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。 3. 细胞形态变化 4. 微生物污染 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 2. 细胞生长情况 细胞传代后，经过悬浮、贴壁伸展进入潜伏期，然后开始生长进入对数生长期，在此时期细胞开始大量繁殖，并逐渐连接成片而长满瓶底后进入平台期，生长受到抑制。贴壁生长的细胞长满瓶底80%即应及时传代，否则细胞会由于营养物质缺乏和代谢产物堆积而进入平台期并衰退。这时细胞轮廓增强，胞内常出现颗粒状堆积物，严重时细胞甚至可从瓶壁脱落。悬浮生长的细胞当增长显著、培养液开始变黄时也应及时传代。 培养细胞常规检查内容和方法 1. 培养液 2. 细胞生长情况 3. 细胞形态变化 生长状况良好的细胞镜检观察时透明度大、边缘整齐、折光性强、轮廓不清；用相差显微镜观察能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。细胞生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，边缘不整齐，细胞发暗，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞之间空隙加大，细胞变得不规则，甚至失去原有特 培养细胞常规检查内容和