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实时荧光定量PCR实验原理与技术 胡晓 研究生实验技术 2015-12-7 qRT-PCR技术原理 一、实验原理：在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 荧光信号 + 标准曲线 定量分析？ qRT-PCR技术原理 Ct值(Cycle Threshold;每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。 以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。 实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。（定量分析） qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA 双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。 常用染料：Pico Green （灵敏度高,=25pg/mL） SYBR I 缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。 措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。 qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 2.特异性荧光定量PCR:以荧光共振能量转移原理为基础 水解探针法 分子信标 Scorpion引物/探针 复合探针 qRT-PCR技术影响因素 样品RNA 的完整性 RNA 样品中的基因组 DNA污染 特异性良好的引物 PCR反应体系的优化 反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的mRNA的量 可靠的内标基因： TEF-2 qRT-PCR技术实验操作 qRT-PCR技术实验操作 阳性模板 qRT-PCR技术实验操作 制作标准品阳性对照：测定阳性模板的浓度，10倍稀释为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 反应体系如下: (标准品反应体系) 序号 反应物 剂量 SYBR Green 1 染料 10μl 阳性模板上游引物F 0.5μl 阳性模板下游引物R 0.5μl dNTP 0.5μl Taq酶 1μl 阳性模板DNA 5μl ddH2O 32.5μl 总体积 50μl 3. 轻弹管底将溶液混合，短暂离心。 (内参照基因反应体系) 序号 反应物 剂量 SYBR Green 1 染料 10μl 内参照上游引物F 0.5μl 内参照下游引物R 0.5μl dNTP 0.5μl Taq酶 1μl 待测样品cDNA 5μl ddH2O 32.5μl 总体积 50μl qRT-PCR技术实验操作 1、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板： ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 序号 反应物 剂量 1 10× PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul ddH2O 至25ul ②轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）;72oC延伸5分钟。 ③ PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 ④
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