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色质分析样品前处理（一） 韩莉妲 前言 期望解决的问题 基因——代谢物——最终表型的相互作用 什么作用（定性分析） 作用的程度 （定量分析） 代谢物组成及其合成途径 已鉴定代谢物及其生理作用（如何作用于植物生长） 信号传导，基因调控和不同代谢途径间作用“cross-talk of metabolic routes”） reverse approach is the only method of choice From single target to high throughput untargeted detection profiling techniques: MS LC/MS GC/MS NMR greatly enhanced our knowledge about the chemical constituent of plants continuously expanding data bases which can be queried for metabolite specific characteristics 色质联用及其特点 色谱分析主要步骤 典型色谱分析中误差来源和时间消耗对比 前处理方法建立前应了解 能得到的仪器和设备 了解被测物： 物理化学性质：溶解度，挥发性，活性基团等 浓度范围以及所需的检测低限 样品基质的物理和化学形式 能得到的样品量 样品前处理过程潜在的交叉污染 了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用 前处理方法的选择和确定 与分析人员沟通，共同建立分析方法！ 利用文献方法（推荐） 需要验证，重现 成本低，速度快，但可能难以找到现成的文献支持 建立新方法，需进行方法学考察 方法学开发成本高：成本需数千至数万元 方法学建立过程耗时：数周至数月，繁琐，复杂 Eight Steps Method Validation 根据具体实验目的，考察并报道以上一项或多项数据。 主要内容 样品采集注意事项 均匀性——使采集的样品具有代表性 当均匀性较差：加大取样量——均匀化后取样(固体样品需粉碎——研磨或捣碎） 采集和贮存过程中不应损失和发生化学变化 预测组分的挥发：低温 吸附于：贮存容器壁、样品中的固体颗粒 氧化和分解：采样后应及时处理、低温、避光、无氧 其它化学反应：组分间？采集和贮存过程中被污染 注意清洁：采样工具、贮存容器、反应容器 样品前处理 为什么要进行样品前处理? 浓度太低- 被测物浓度低于定量限 样品太“脏”- 基质组分的存在影响样品测定 太“危险”- 污染物可能成为“色谱柱杀手” 样品前处理 样品（samples） →→→ 供试品/被测样（analytes） 目的：纯化和浓缩样品，使被分析物适于所选分析方法（例如色质分析） 样品前处理 样品（samples） →→→ 供试品/被测样（analytes） 色质分析中，所得供试品应满足： 所选色谱柱的进样要求 所选色谱方法的分离能力 有良好分离度 若无良好分离度，则应采取预分离 检测器（——质谱）的检测能力 质谱是通用型检测器 我所采用的质谱：主要用于有机化合物检测 例如，液相色谱洗脱剂中，避免使用非挥发性的无机盐 常用样品制备技术 浸提：溶剂提取 浸提方法的选择 冷浸：注意不时混匀 推荐 48~72h 超声可提高浸出效率 热浸：常用加热回流 推荐 24~36h 加温：增加待测物的溶解度和扩散速度； 破坏溶质与基质之间的相互作用； 降低溶剂的粘度(更好的穿透性)； 降低表面张力(更好的润湿性) 浸提溶剂的选择 浸润性、穿透力最好：推荐 85~95%乙醇 样品前处理中的常用技术 浸提：溶剂提取（10~50倍溶剂） 冷浸： 温浸： 加热回流： 加温：增加待测物的溶解度和扩散速度； 破坏溶质与基质之间的相互作用； 降低溶剂的粘度(更好的穿透性)； 降低表面张力(更好的润湿性) 萃取： 液-液萃取：传统方法 液-固萃取：如 SPE 样品前处理中的常用技术 传统液液萃取法（Liq-liq extraction） 方法： 选择与样品溶剂不相溶的溶剂，充分振摇 静置——两种不同的溶剂分层 合适的液液萃取方法应满足： 目标分析物在萃取溶剂中的溶解度更大 干扰分子仍留于样品中 传统液液萃取方法的缺陷： 对样品量需求较大 耗费大量有机溶剂 操作费时，分离效率较低 SPE(Solid Phase Extraction,固相萃取)简介 最早于上世纪70年代提出，至今已发展成多领域样品预处理的标准模式，商品化程度高 属于色谱技术的一种– 化合物要么