药学毕业牛黄天龙胶囊 含药血清 诱导人子宫内膜癌hecb细胞凋亡及其机制.docVIP

XX大学 毕业论文 牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌HEC B细胞 凋亡及其机制 姓 名： 2014年6月25日 牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌HEC B细胞凋亡及其机制 作者：田彦玲，王玉花，程建新，刘京生 【摘要】 目的观察牛黄天龙胶囊（含药血清）对人子宫内膜癌HEC B细 胞能否诱导凋亡并对其抗癌机制进行探讨。方法实验组分低、中、高3个剂量 组并设空白组和阳性对照组进行含药血清的制备；MTT法观察细胞毒作用；细 胞排染法观察瘤细胞直接损害实验；叮旋橙臭化乙锭（AO/EB）双荧光染色法 及电镜（TEM）下观察细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术（FCM）测定细胞 凋亡率并进行细胞周期 分析，测定凋亡抑制蛋白survivin和凋亡效应蛋白Caspase 3的表达。结果 MTT法：人子宫内膜癌HEC B细胞经含药血清作用后细胞生长受到明显抑制 且以低剂量组抑制率最高。细胞排染法：同一时间段内以低剂量组效果最好，不 同时间段内（24、48h）细胞抑制率显著提高（PO.Ol）o AO/EB和TEM：实验组均 可见到典型细胞凋亡的形态学变化。FCM：实验组各组细胞凋亡率与空白组相 比差异有显著性（P0.01）且以低剂量组最高，细胞周期分析显示实验组GO/ G1期 细胞明显增多而S期细胞明显减少与空白组相比差异有显著性（P0.01）, Survivin 蛋白表达在空白组最高，在实验组表达降低与空白组相比差界有显著性（P0.01）, Caspase 3表达则相反，在实验组表达最高与空白组相比差异有显著性（P0.01）。 结论复方中药“牛黄天龙胶囊”（含药血清）能够使人子宫内膜癌HEC B细胞 生长阻滞在G0/G1期并可诱导人子宫内膜癌HEC B细胞凋亡；并可降低凋亡 抑制蛋白survivin表达同时可提高凋广效应蛋白Caspase 3表达,这可能是其诱 导人子宫内膜癌HEC B细胞凋亡的机制之一；对人子宫内膜癌HEC B细胞 的抗肿瘤作用并非浓度越大效果越好而有一最适剂量。 【关键词】 血清药理学；细胞凋亡；AO/EB双荧光染色法；TEM； FCM. Key words: Pharmacology; Cell apoptosis; AO/EB double fluorescent dye staining; Transmission electron microscope； Flow cytometry 大量研究表明，复方中药制剂可通过阻滞肿瘤细胞牛长周期，影响癌 基因和抑癌基因表达等途径发挥抗癌活性［1］。我们所用方剂“牛黄天龙胶囊，是 在传统抗肿瘤中药方剂“犀黄丸”⑵基础上添加了新的抗肿瘤中药成分，针对妇科 肿瘤而研制的新的抗癌组方。本研究运用血清药理学方法从细胞、分子和基因水 平对牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌HEC B凋亡的作用机制进 行了初步探讨，旨在为筛选有效的抗妇科肿瘤的中药方剂提供理论依据。 1材料与方法 1」实验动物 Waster大鼠40只，雌性，清洁级动物，体重（280±30）g, 合格证号：DK0402 0086,由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2实验药物 复方中药牛黄天龙胶囊主要由牛黄、麝香、乳香、没药等 十几味屮药组方（生药购自河北省石家庄乐仁堂中药饮片厂）由河北医科大学第 四医院药剂室按工艺制成，相当于含生药量每胶囊2.5go 1.3细胞株 人子宫内膜癌中分化细胞系HEC B细胞由北京戻科大学 附屈第一医院北京医院妇科科研室提供。 1.4主要仪器和试剂PRMI 1640培养基为美国Gibco公司产品；胰蛋 白酶，丫噪橙（AO）,漠化乙旋（EB）由美国Sigma公司提供；胎牛血清由河 北医科大学第四医院科研中心提供；顺钳（冻干型）购自山东省徳州制药厂，产 品批号031001； CO2培养箱,美国Forma Scientific公司产品;倒置相差显微镜 （XS2 D2型），荧光显微镜（Nikon UFX II型）均购自口本Olympus公司； 透射电子显微镜为日本日立H 7500；流式细胞仪420为美国B?D公司产品。 1.5方法 1.5.1含药血清的制备[3,4]将40只Wistar大鼠随机分成5组：阴性对 照组（空白组），实验组（分高、中、低剂量组）和阳性对照组（顺钳组）。实验 组高、中、低三组每日用药剂量分别按1/10LD50、1/20LD50、1/40LD50给药， 以每只2ml/次灌胃，阳性对照组采用腹腔注射每只1ml/次（剂量按每只5mg/kg /天计算）。采用李仪奎“通法原则”方案，即每口剂量分2次灌胃（灌胃前禁食12h 不禁水）连续3d,于第3d第1次给药2h后再给药一次，间隔lh以乌来糖腹腔 注射麻醉，背位固定，无菌条件下腹主动脉取血，分离血清，56°C, 30m