RT_PCR与产物电泳分析20161101.ppt

RT-PCR及其产物电泳分析 中南大学 生命科学学院 实验目的 熟悉RT反应的原理；掌握RT反应的操作步骤 熟悉PCR反应的原理 掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化 掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法 实验原理 RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退火；（3）延伸 。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表达最常用的方法。 RT反应试剂 （1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%） （2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ） （3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 （6）RNasin PCR反应试剂 （1）引物：一对，单链的10-30nt长的DNA片段。 （2）Taq DNA聚合酶 （3）PCR反应缓冲液：常用10×浓度，一般组成为15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl等。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 6 微量移液器 台式微量离心机 电泳槽 凝胶成像系统 主要仪器 电泳仪 热循环仪 实验步骤 （1）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入： RNA溶液 5 μL RT mix 15 μL 20 μL （2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心 30 s，使反应成份均匀富集于管底。 （3）42 ℃水浴30 min 。 RT mix的成分：RNasin、5×RT反应缓冲液、2.5mM dNTPs、Oligo(dT)16、逆转录酶(MMLV) 实验步骤 （4）标记一个洁净的200μL反应管，向其中依次加入： ddH2O 6 μL 2×PCR mix 10 μL Primer mix 2 μL cDNA模板 2 μL 20 μL （5）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。 PCR mix的成分：PCR反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、Taq DNA聚合酶 实验步骤 （6）在PCR仪上设置反应循环参数: 本次实验为：94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环数为26，最后于72 ℃充分延伸5 min后，终止反应。 （7）置反应管于PCR仪上进行热循环。 （8）反应完毕后，取5 μLPCR产物，于1.5 ％琼脂糖凝胶电泳检测结果。 注意事项 1. 戴手套操作，避免污染。 2. 尽量冰上操作。 3. 取样准确，体系正确。 4. 一定要有内参。 PCR平台期 PCR扩增有限性-平台期 经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA分子数不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。 PCR的离子需要 Taq酶活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 一般PCR反应中MgCl2浓度在2.0mmol/L时酶活性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑制。 变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。 PCR引物用量 一般PCR反应引物的终浓度为0.2～1μmol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。 但引物低于0.2 μ mol/L时，则产量降低。 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。 结果分析 M 1 2 3 M：100bp 梯级DNA分子量标志物；泳道1：阳性对照； 泳道2：靶DNA扩增； 泳道3：阴性对照 图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳 观察结果： ① 是否有扩增产