第七节亲和柱色谱教学课件.ppt

第七节 亲和柱色谱 一、基本原理及过程 亲和柱色谱是亲和力起着特别重要作用的一种色谱分离方法，主要用于生物活性物质(氨基酸、蛋白质、核酸、核苷酸、肽、酶等)的分离，所以又称生物亲和柱色谱或生物特异性亲和柱色谱。 * * 亲和柱色谱方法是建立在某些生物和生物化学过程中特异性相互作用的基础上，这种特异性的相互作用发生在具有高选择性的一对物质之间。 在自然界中，具有这样高选择性而又可逆的亲和力的生物活性物质一般都是相配成对的，称为生物对。 这些生物对中的一方一旦离开另一方，就会失去这种特异的亲和力。 例如，抗体和抗原被时异地结合在一起；酶与其底物或抑制剂起反应，而不与其他物质起作用；激素只与其受体作用等。 * * 如果将生物对中的一种物质以共价键的方式键合在一种适当的载体(如琼脂糖)上，而又不丧失其功能，那么这种固相化的琼脂糖，就可以从溶液中选择性结合该生物对中的另一种物质，将所需要的组分结合到琼脂糖上，其他物质可以用洗脱的方法排除掉，琼脂糖经冲洗再用适当方法使所需要的物质分离并释放出来。 * * 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠（或胶粒） * * 在亲和吸附过程中，需选择和使用合适的平衡缓冲液。平衡缓冲液是样品液通过亲和柱之前之后用于冲洗亲和柱上杂质的溶液。 在洗脱过程中，洗脱液的选择目的在于减弱配基与亲和物之间的亲和力，利用其可逆性使两者组成的络和物完全解离。 常用的洗脱液有: 水、0.1～0.5mol/L NaCI-磷酸缓冲液、0.lmol/L硼酸、0.1～1mol/L乙酸、稀氨水等。 * * 二.亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在载体的表面或孔内即可制备亲和吸附介质。 理想载体应当具备以下性质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大; 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长; 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化; 粒径均一的球形粒子。 亲和色谱的载体主要有琼脂糖、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃等。 * * 目前，许多活化载体已商品化，可供各种配基的固定化。 商品化的亲和吸附介质种类有限，不能满足各方面要求。在实际应用中，特别是在科研工作中往往需要在实验室内合成所需的亲和吸附介质。合成的方法很多，如溴化氰活化法、环氧基活化法、间接固化法、硅胶活化法、间隔臂法等。 * * 三、亲和色谱分离的影响因素 ①pH和离子强度 通常预分离料液中目标产物浓度很低，而杂质大量存在，即使只有少量杂质发生了非特异性吸附，也会大大降低分离纯化的效果。 一般来说，杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、材料、配基固定化法以及缓冲液的离子强度、pH和温度等因素有关。 * * ②料液流速 ③清洗 清洗操作的目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时加入表面活性剂，保证目标产物的吸附和杂质的除去。 由于亲和吸附是可逆的，清洗过度会使目标产物的损失增多，特别是亲和结合较弱的亲和体系；清洗不充分，则使洗脱回收的目标产物纯度降低。 * * ④洗脱 特异性洗脱 洗脱剂中含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物，通过这些小分子化合物与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性。 * * 非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，以达到洗脱的目的。 * * 三、亲和柱色谱操作技术 首先将载体活化，然后把待分离物质的亲和分子对中的一方作为配基，在不损害其生物功能的条件下，固定在不溶性载体上制成吸附介质； 把吸附介质装入色谱柱中，用适当的缓冲液平衡，再将待分离的混合液以慢速通过柱子；混合液中与配基构成亲和生物对的物质被配基吸附结合，并保留在柱中， 用缓冲液洗涤柱子； 用解吸液进行洗脱，被吸附的组分因吸附能力的不同，被分离成一些区带，分别收集流出组分。 在方式与方法方面，整个过程都与其他柱色谱法相类似。 * * 四、亲和柱色谱的应用 亲和柱色谱简单迅速，选择性强，操作条件温和，分离效率高，对含量极少而又极不稳定的活性物质的分离比较有效。 缺点在于使用范围受限，因为并非所有物质都可找到与之相配对的配基物质。 目前，亲和色谱在酶、蛋白质、酶的抑制剂、抗体和