酶联免疫吸附.ppt

ELISA的类型 一）双抗体夹心法测抗原 利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与 固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成 抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的 形成量与待测抗原含量成正比，属于非竞争性 反应。 抗体 固相抗体 保温 受检标本 抗原 洗涤 酶标抗体 抗体 酶标 洗涤 加底物 保温 洗涤 此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原， 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能 形成两位点夹心。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子 （RF）的干扰。采用F（ab‘）或Fab片段作酶结合物 的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。 抗体的选择：如抗体的来源为抗血清，包被和 酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。 二）间接法测抗体 原理为将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的量与待测抗体量成正比，也属于非竞争性反应。 抗原 固相抗原 洗涤 受检血清 抗体 洗涤 酶标抗抗体 抗抗体 酶标 洗涤 加底物 保温 保温 主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓 度的非特异性IgG ，非特异IgG可直接吸附到固相 载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。 在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（BSA） 再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间 隙。在检测过程中标本须先行稀释（1:40～ 1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 三）竞争法 可用于检测抗原和抗体。用酶标抗原（抗体）与待测 的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量 抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非 标记复合物多，酶标复合物就少，故显色程度与待测 物含量成反比。 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量 四）捕获包被法测抗体 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。 抗人IgM固相抗体的形成 加入血清标本，形成抗人IgM固相抗体-特异性IgM抗 体复合物 加入抗原，形成抗人IgM固相抗体-特异性IgM抗 体-抗原复合物。 加酶标记针对抗原的特异性抗体，形成抗人IgM固相 抗体-特异性IgM抗体-抗原-酶标抗体复合物。 酶再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。 此法常用于病毒性感染的早期诊断。 ELISA常用技术类型比较 类型 固相载体上的包被物 待测物 酶标记物 显色程度与待测物含量间的关系 双抗体夹心法（一步法） 抗体A 抗原 酶标抗体B 正相关 间接法 抗原 抗体 酶标二抗 正相关 竞争法 抗原（抗体） 抗体（抗原） 酶标抗体（抗原） 负相关 捕获法 抗IgM IgM 酶标抗体 正相关 ELISA的操作要点 1 标本的采取和保存 广泛：体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物 （如尿液、粪便），大部分检测以血清为标本。 5天内测定的血清，4℃，超过一周，低温冰存。 冻结血清融解后，应充分混匀，避免气泡 。 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。 测抗体的血清如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。 3 加样 2 试剂的准备 　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 从冰箱中取出的试剂应待温度与室温平衡后使用。 试剂盒中本次试验不用的部分应及时放回冰箱保存。 一般有3次加样，即加标本，加酶结合物，加底物。 加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 4 保温（温育） 　　常采用43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。 37℃是常用的保温温度。 也采用4℃过夜，抗原抗体反应4℃更为彻底。 一般采用水浴，将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应 贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖 ，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应 板漂浮在水面上。  5 洗涤　　 通过洗涤来达到分离游离的和结合的酶标 记物的目的。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动 洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。 浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液； b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）； c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动， d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸， 也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。　　 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。 6 显色和比色 OPD底物显色在室温或37℃反应20-30分钟后