第五章 分子生物学研究方法(上).pptVIP

第五章 分子生物学研究方法 基因工程也称为重组DNA技术。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程。 基因工程是重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 5·1 重组DNA技术 ④限制性内切酶的发现： ⑤连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，1970年Khorana又发现了T4 DNA连接酶，它具有更高的连接活性，现广泛应用于DNA操作中。 ⑥1970年，Mandel和Higa发现，大肠杆菌经适量氯化钙处理能有效吸收噬菌体DNA。 ⑦1972年，Cohen等报道氯化钙处理大肠杆菌能摄取质粒DNA。大肠杆菌成为分子克隆中常用的转化受体。 基因工程诞生的标志 基因工程的诞生（一九七三年） 综合S.Cohen 和P.Berg创造性的研究成果，“ 在细胞外，把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内的无性繁殖获得成功”，这一工作内容定义为基础工程，世界上第一次完成这项工作内容的1973年被公认为基因工程诞生的元年。 ●核酸内切限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 ● DNA连接酶 ——基因工程的缝纫针 ●主要载体系统 理想载体的基本条件 根据质粒载体的用途进行分类 克隆载体(cloning vector)指使插入的外源DNA序列被扩增为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体。 表达载体(expression vector)能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体 常见的克隆载体 质粒载体 （plasmid vectors） λ噬菌体载体（λphage vectors） 柯斯质粒载体（cosmid vectors） M13噬菌体载体（M13phage vectors） 噬菌粒载体、YAC、BAC ：高容量载体 质粒克隆载体 电泳迁移率：SC DNAL DNAOC DNA 1.共价闭合环状（covalently closed circular DNA,CCC）或超螺旋构型（SC） 2.开环构型（open circular , OC） 3.线性构型（ linear ,L） 质粒载体的一般结构 重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体 pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，该质粒编码有一个四环素抗性基因，含有7种核酸内切限制酶的单切割位点，其中有3个位点克隆外源DNA会导致四环素抗性基因失活。 2.pBR322质粒载体 目前基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，是按设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。 3、pUC质粒载体 包括4个组成部分： （1）来自pBR322质粒载体的复制起点； （2）氨苄青霉素抗性基因； （3）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-多肽链的DNA序列，此结构称为lacZ/基因； （4）位于lacZ/基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。 二、噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒的总称。其结构比质粒要复杂，噬菌体的DNA除了复制起点以外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。 λ噬菌体载体 λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，是迄今为止研究得最清楚得一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。 λDNA为线状双链分子，长度为48 502bp，已经定位得λ噬菌体的基因至少有61个，其中一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，称这类基因为λ噬菌体的必要基因。 另一部分基因则被称为非必需基因，被外源基因取代后不影响生命周期。 在λDNA分子两端，各有12个碱基的单链互补黏性末端，当λDNA被注入寄主细胞后，会迅速地通过黏性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由黏性末端结合形成的双链区段，称为cos位点。这样形成的载体称为柯斯质粒。这种质粒能容纳大片段的外源DNA插入，对构建真核基因组片段的基因文库是特别有用载体。 所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 表达载体