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第四章 工业发酵灭菌 第一节、灭菌的方法 消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 作用：消灭杂菌和防止杂菌污染. 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 常用灭菌方法： 干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）、过滤除菌； 1、干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热 主要用于保持干燥的物料、器具等. 常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h 2、湿热灭菌法 原理：借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 灭菌条件： 121℃，30min。 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅 湿热灭菌的原理 湿热灭菌的优点： 1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底 3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易 缺点： 1)设备费用高 2）不能用于怕受潮的物料灭菌 3、射线灭菌 紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线 适用范围：无菌室、培养间 问题：是否适于固体、液体物料灭菌？波长范围？ 4、化学药品灭菌法 三、加热灭菌的原理 1、湿热灭菌中的相关定义 致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间；在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 一级反应： 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即： 式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。 积分边界条件：N0→Nθ；t0=0 3、热致死反应的速度常数K K是表达微生物耐热性的特征常数 ，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热。温度越低， K值越小。 培养基灭菌的要求： 达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。 培养基湿热灭菌需解决的工程问题 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： 杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围 四、影响培养基灭菌的其他因素 培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫 2、灭菌时间的计算 如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中 所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被 杀灭，这样可以简单地利用右式， 粗略地求 得灭菌所需的时间： 4 保证间歇灭菌成功的要素 内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。 4、分批灭菌的注意事项 1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 2）排气量不宜过大，以节约蒸汽 3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。 2、连续灭菌的优点： 1）可以采用高温短时灭菌； 2）发酵罐利用率高； 3）蒸汽负荷均衡； 4）热效率高； 5）可采用自动控制，降低劳动强度； 3、连续灭菌时间的计算 如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中 所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被 杀灭，这样可以简单地利用右式， 粗略地求 得灭菌所需的时间： 4、连续灭菌流程 七、培养基与设备、管道灭菌条件 1、灭菌锅内灭菌 2、种子培养基实罐灭菌 3、发酵培养基实罐灭菌 4、发酵培养基连续灭菌 5、消泡剂灭菌 6、补料实罐灭菌 7、尿素溶液灭菌 ［例3-1］ ［例3-1］有發酵培養基40m3 ，原始污染程度為105個菌/mL，要求無菌程度Ns為10-3個菌/批，若滅菌溫度125℃時滅菌速度常數為1 min-1，求所需要滅菌時間。 解：已知N0=40×106×105=4×1012個菌/批 Ns=10-3個菌