第2章10基因工程基因文库的构建.pptVIP

1、基因文库(gene library)概念 是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。 （六）构建基因组文库应注意的问题 构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。 部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。 在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06。 包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。 （七)原核生物基因组文库的构建 1、原核生物基因组的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb。 防止在制备过程中的机械断裂。 2、酶切片段与载体连接 ⑴酶切片段及分离、纯化 基因组的不完全酶切 ①根据实验需要选择合适的限制性内切酶 —四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 —六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 ②分离目的酶切片段大小的确定 —克隆单个基因： 10 kb —克隆基因族： 20kb ③DNA不完全酶切条件的确定 —确定限制酶用量，改变酶切时间 —固定酶切时间，改变限制酶的用量 4、基因组DNA文库克隆子保存与筛选 ⑴基因组DNA文库的保存 ①文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80℃储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。 从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重 要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知 识密切相关。目的基因的背景知识包括： 目的基因的部分或全部碱基序列已知。 目的基因编码产物的结构或功能已知。 目的基因与某些生物表型的相关性已知。 (三)cDNA文库构建的步骤 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 第一链cDNA合成 第二链cDNA合成 双链cDNA的分级分离 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 重组体的筛选与鉴定 1、细胞总RNA的提取和mRNA的分离 mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。 mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备 mRNA完整性的检测 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间。 随机引物引导的cDNA合成法 ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’末端的oligo(dT)引物一处开始。比较容易合成特长的mRNA分子的5‘端序列 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。 2、cDNA文库的主要优点 ①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ②cDNA文库的筛选比较简单易行。 ③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 ④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 ⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的