血清γ—球蛋白的分离、纯化与鉴定.pptVIP

血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定（一） Isolation ,Purification and Identification of γ- Globulin From serum 沈阳医学院生物化学教研室 一、目的和要求 学习盐析法分离血清蛋白的原理和技术 掌握凝胶过滤层析法脱盐的基本操作技术 掌握用醋酸纤维膜电泳法分离血清蛋白的原理及方法 二、原理 （一）盐析 1.概念和原理 盐析是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 蛋白质在纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”(salt in)。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析” (salt out) 。 “盐析”破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素 但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜 另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来 2.常用中性盐： 盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是硫酸铵。 硫酸铵的优点 1. 在水中化学性质稳定， 2. 溶解度大， 3. 溶解度的温度系数变化较小， 4. 硫酸铵价廉易得，分离效果好， 5. 性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。 3.盐浓度计算 各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度各异，所需的最小盐量称做盐析浓度。 (1)饱和硫酸铵溶液法 将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1 离心力(F)等于被离心的物体质量与向心加速度的乘积 向心加速度 = 4π2V2r （其中V为每秒的转数，r为离心半径，单位cm） F=m 4π2V2r 相对向心加速度= 4π2V2r g 多少个g 2.离心机分类 根据离心机的转数分类可以分为三类 ① 5000rpm 普通离心机 ② 5,000-25,000rpm 高速离心机 ③ 25,000-10,000rpm 超速离心机 因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有制冷装置 超速离心机不但有制冷装置，而且离心室密封真空 三、操作 (三)层析(chromatography) ---纯化 层析利用物质在固定相（stationary phase）与流动相（mobile phase）之间不同的分配比例，达到分离待测物质的技术。 脱盐常用透析法和凝胶过滤层析法 前者的优点是透析后样品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽 凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品体积较大。 本实验中样品体积较小，凝胶过滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 结果 (四)电泳 (electrophoresis) ---鉴定 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳 血清蛋白包括多种蛋白质，它们的等电点大都在pH7.0以下，清蛋白的等电点为4.6，球蛋白为5-7 在PH高于它们等电点的缓冲液均带负电荷，在电场中向正极移动 由于各种蛋白质所带电荷的数量和分子的大小有差别，在电场中泳动的速度也不同 血清中清蛋白电荷数量较多，分子量小，泳动最快。 γ球蛋白则相反，泳动最慢，适当的时间电泳后，不同的蛋白泳动到不同的位置。 原理 操作方法 一、仪器和薄膜的准备 1．将醋酸纤维薄膜浸泡于TEB缓冲液中，一小时以上备用。 2．在电泳槽内加TEB缓冲液每槽100ml（视槽的大小而定）。放置好滤纸桥。 将点样面朝下，点样端在负极，悬于滤纸桥上，盖好电泳槽盖，将电压调至130-160V，电流约为0.4-0.6毫安/厘米，通电40～50分钟，待电泳区带展开约3.5cm时断电。 * * 表面电荷 水化膜 A，G A G ↓ 半饱和(NH4)2SO4 饱和(NH4)2SO4 A ↓ 血清中清蛋白和球蛋白的分离 按体积： 1 2（50%）； 1 4（25%） 按体积： 1 2（50%）； 1 4（25%） (2)固体硫酸铵法 可采用直接加入固体硫酸铵的方法。 硫酸铵饱和度的计算 （二）离心 (centrifugation) ---- 分离 1.离心力 3.离心机的使用