分子生物学分子克隆技术.pptVIP

基因操作技术及其应用 参考书目资料 《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著, 黄培堂等译，科学出版社，2008. 《Gene IX》：Benjamin Lewin编著. 《基因工程原理》：吴乃虎，科学出版社，1998. 《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007. 《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005. 分子克隆 基因工程的核心技术是DNA重组技术 分子克隆技术 又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 (“交通工具车子”)——载体 有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。 逆转录酶 使真核基因的制备成为可能。 （1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。 （2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNA→cDNA (complementory DNA)得到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。 四、分子克隆的技术支撑 核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术 内切酶 同裂酶(Isoschizomers） 同尾酶 星活性* 所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。 Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high ( 5% v/v) glycerol concentrations. High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity. DNA聚合酶 Taq酶 用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。 Pfu酶 产生平末端产物。 连接酶 T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。 基因工程的载体---用于扩增 克隆载体必备条件 表达型基因工程的载体----以PET32为例 多克隆位点 宿主 要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子 目的产物 目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物 目的基因的高效分泌表达 概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外 优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离 需要在质粒设计时加入一段信号肽基因 基因克隆操作过程 克隆示意图 克隆示意图 保护碱基 1.用限制性酶消化 DNA 样品 单酶切 双酶切 选择合适的双酶切缓冲液 2.用限制性内切酶消化质粒DNA 3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 连接前最好要定量 连接比例摩尔比例为： 插入片度：质粒=10:1---5:1为佳。 质粒几十个ng为佳。 冷循环器 4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。 用氯化钙化学转化 用氯化钙化学转化 电激转化 一个电激转化程序 加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中 将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡 2-4 小时。分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。 5. 细菌在