细胞转染简介.ppt

(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。 病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。 （1）逆转录病毒 （2）腺病毒 四 转染后筛选 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上所带的真核筛选抗性基因有关的 。 标有neo（实际上应该是neo resistance）的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因细胞的阳性筛选。 标有amp（实际上应该是amp resistance）的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（β－内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏感菌有作用。用于克隆菌的筛选。 最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo，所以筛选的时候用G418 。G418是目前获得稳转最常用的试剂之一。 G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可以将G418转变成无毒性状。 * 分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。2.在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞（如HEK，CHO），悬浮细胞（如HL 60，Jurkat）非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。 3.传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度（通常在一个实验室范围内）。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学（以及转染能力）性质也可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。4.只要培养基质（组织培养皿）尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制（接触抑制），但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。 * 载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。2各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物（如CsCl，内毒素）可能会影响转染效率。 * 培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。配置时要使培养基务必避光保存；因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。2血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。3某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。 * 诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物；如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。2所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄；而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。3有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓