水的大肠菌群检测方法.docxVIP

4 ． 1 在 2 个装有 50ml 三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样 100mL 。 4 ． 2 在 10 支装有 5mL 三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL 。 4 ． 3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36 ±1 ℃培养箱中，培养 24h 。 4 ． 4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进 一步的证实试验。 证实试验 5 ． 1 平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液， 接种到伊红美蓝琼脂平板上， 置 36 ± 1 ℃培养箱培养 18 ～24h ， 观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5 ． 2 复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落 1 或 2 个进行革兰氏染色， 同时接种乳糖发酵管， 于 36 ±1 ℃培养箱中， 培养 24h 。 5 ． 3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的 阳性管数，查最大可能数（ MPN ）检索表得出 1000mL 水样中总大肠菌群的 MPN 值。 总大肠菌群（ MPN ）检索表 二、大肠菌群膜法测定 定义 大肠菌群（ coliform bacteria ）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选 择性培养基上，经 37 ℃培养 24 小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。 仪器 2．1 滤器 2 ． 2 滤膜，孔径 0 ．45 μ m 。直径根据滤器规格，目前常用的有 35mm 和 27mm 两种。 2．3 抽滤设备 2．4 无齿镊子 2 ． 5 其它仪器见《 GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第 3 章。 培养基 3 ． 1 品红亚硫酸钠培养基 3 ． 1 ． 1 成分：蛋白胨 10g 酵母浸膏 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 琼脂 10 ～ 20g 磷酸氢二钾 3． 5g 无水亚硫酸钠 5g 5 ％碱性品红乙醇溶液 20mL 蒸馏水 1000mL 3 ． 1 ． 2 储备培养基的制备 将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有 900mL 蒸馏水的烧杯中，溶解后调 pH 值到 7 ．2 ～ 7 ．4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至 1000mL ，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定 量分装于烧瓶内，  115 ℃高压灭菌  20min  ，置冷暗处备用。 3．1．3  平皿培养基的制备 将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基按  1∶50  的比例，用灭菌吸管吸 取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按  1∶200  的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭 菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌  10min  。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为止。将此亚硫 酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀  （防止产生气泡） ，立即将此种培养 基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培 养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 3 ． 2 乳糖蛋白胨培养液 见《游泳池中大肠菌群多管发酵测定法》 操作步骤 4 ． 1 滤膜灭菌：将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次 15min 。前两次煮沸后需更换水洗 涤 2 ～ 3 次，以除去残留溶剂。 4 ． 2 滤器灭菌：用 121 ℃高压灭菌 20min 或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 4 ． 3 水样过滤：用无菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分，将滤膜粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，打 开滤器阀门，在－ 0 ． 5 大气压下抽滤。 4 ． 4 培养：水样滤完后，再抽气约 5s ，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后 将平皿倒置，放入 36 ± 1℃恒温箱内培养 18 ～ 24h 。 4 ． 5 挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落； 深红色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡红色，中心色较深的菌落。 4 ． 6 将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于 36 ±1 ℃培养 48h 。产酸产气者 证实为大肠菌群阳性。 检验结果报告 计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以 10 即为每 1000mL 水样中的大肠菌群数。