分子生物学实验II新教案.pdf

分子生物学实验II （蛋白质的表达、纯化及检测） 实验一：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 【实验目的】 通过本实验了解外源基因在原核细胞中诱导表达情况。 【实验原理】 将外源基因克隆在使用含有lac 操作子的启动子的表达载体中，让其在E.coli 中表达。 lacI LacI lac 首先在不加诱导剂的条件下培养宿主菌， 基因表达的产生的阻遏蛋白 与 操作子 结合，从而不能进行外源基因的表达；然后向培养基中加入诱导物IPTG，此时LacI 阻遏蛋 白变构失活，不能与lac 操作子结合，外源基因表达。 【实验仪器、材料与试剂】 实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机等。 菌株和质粒：菌株：大肠杆菌BL21；重组质粒pET-X：基因X 与pET-30a重组。 主要试剂  50mg/ml 卡那霉素；  1M IPTG 8gIPTG Sigma 10mLddH O 0.22μm ：将 （ 产品）溶于 2 中，用 滤膜过滤除菌， 每份1ml，贮存于-20℃。  LB 液体培养基 胰蛋白胨 （tryptone） 10g 酵母酵母膏 （yeast extract） 5g Nacl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH(1M)调节PH 至7.0，加入去离子水至总体积为 1L，121℃湿热灭菌20 分钟。 【实验步骤】 1．种子液的制备 挑取LB 固体平板上的大肠杆菌BL21（pET-X）单菌落，接种于含5μl 卡那霉素的5mlLB 1 37 200rpm ( 液体培养基的试管中， ℃， 振荡培养过夜。注意取菌株要在超净工作台上操作， 一定注意无菌). 2．转接培养 取50μl菌液分别转接到两支含有5μl卡那霉素的5mlLB液体培养基试管中（1%接种量）， 37℃、200rpm 转接培养。 3.IPTG诱导表达 当培养2－3 小时，使其OD 值达0.6左右，开始向一支试管中加入5ul 1M 的IPTG（终 600 浓度为1mM）进行诱导表达6 小时，另一支试管作为对照不加IPTG。 4. 取样 诱导表达6 小时后，取1.ml 菌液，12000rpm 离心1分钟，弃上清，收集菌体沉淀。-20℃ 保存。 2 实验二：蛋白质变性SDS电泳分离 实验目的：分离不同分子量的蛋白质 实验原理： 蛋白质电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一，电泳是指带电粒子在电场作用下， 向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同，有琼脂糖凝胶电泳，淀粉 凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用，样 -9 -12 品用量少(1-100μg)，分辨率高，可检出10 -10 mol的样品，凝胶机械强度大，重复性好以及 可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应 用。 SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定 蛋白质分子量。其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS的样品处理液是在 要跑电泳的样品中若含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DT