1003总结载体构建说明书.docxVIP

常用载体构建说明书 杨慧丽 2016年4月 步骤： 基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶） 制备感受态大肠杆菌 设计引物 Pcr扩增 Pcr产物检测 Pcr产物回收 双酶切pcr产物和质粒 酶切产物回收 目的基因与载体连接 转化感受态大肠杆菌 单克隆检测 测序比对 提质粒 酶切验证 转化感受态农杆菌 单克隆检测 侵染液配制 一、基本耗材准备 1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司） 常用抗生素 Kan（卡那） Amp（氨苄） Rif（利福平） 母液浓度 ：Kan 50mg/ml Amp 100 mg/ml Rif 100 mg/ml 工作浓度：Kan 50ng/ul Amp 100 ng/ul Rif 100 ng/ul 举例：称取kan固体1g 于注射器中，加入20ml ddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:1000 注意：Rif溶解时加入DMSO 2、培养基的配制 LB液体培养基 1000ml 200ml 牛肉膏 5g 1g 蛋白胨 10g 2g 氯化钠 10g 2g LB固体培养基 1000ml 200ml 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂粉 5g 10g 10g 15g 1g 2g 2g 3g 120℃高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。 3、离心管、枪头、三角瓶 0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个 10ul、200ul、1000ul 枪头各2盒 50ml、100ml、250ml 、500ml三角瓶各2个 去离子水或双蒸水500ml 二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工） BT Media 培养基制备：1支BT Media加50 ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可 准备工作：将BT Buffer A和BT Buffer B 放冰上遇冷，遇冷低温离心机至4℃ 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。 挑取一个正常生长的菌落，接种至10-15ml液体LB培养基中，于37℃摇床充分震荡（200rpm）培养2-16h。 将上述活化好的菌液0.5ml接种至准备好的50ml BT Media中，于37℃摇床充分振荡培养至菌液OD600=0.5-0.6（注意监测菌液OD值，通常所需2-3h）。 将菌液至50ml离心管中，冰上放置5-10min。 于4℃，3500-5000rpm离心5min收集菌体沉淀。 每50ml培养物菌体沉淀用16ml冰上预冷的BT Buffer A轻柔充分重悬菌体，冰上放置10-15min。 于4℃，3500-5000rpm离心2-5min收集菌体沉淀。 每50ml培养物菌体沉淀用4ml冰上预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体，按每管100ul分装到冰上遇冷的1.5ml离心管中。 直接用于转化或用液氮冻后于超低温中保存。 三、设计引物 以CUB表达载体为骨架，cox2c 为插入基因为例 1、分析插入区域可选酶切位点 载体可选酶切位点:Eco53kI、SacI、XmaI、SmaI、BamHI 查看目的基因上是否含有上述酶切位点，以SacI为例，查找结果如下： 目的基因上没有SacI酶切位点，则SacI可作为候选的酶切位点之一。同理，BamHI也可作为候选的酶切位点之一。（同时这两个酶为常见酶，实验室有保存）因此，选取的酶切位点为SacI和BamHI，且BamHI在前，SacI在后。 2、查看保护碱基 在网页上搜索保护碱基表， 由于设计引物方向为5，到3，端，我们选的保护碱基为识别位点前黑色部分，及BamHI为cg或cgc，SacI为c 3、确定左右引物长度 根据Snapgene view 选取目的基因合适长度， 左引物组成： 保护碱基+酶切位点1+目的基因序列（ATG开始） Cg ggatcc ATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC 利用Ssrhunter 对选取目的基因序列反向互补 右引物组成： 保护碱基+酶切位点2+目的基因序列（终止密码子开始） C gagc