分子生物学与基因工程实验教学大纲.docVIP

分子生物学与基因工程实验教学大纲 课程性质： 生物科学专业必修课程，本课程需要以遗传学、生物化学、酶学、分子生物学等课程为基础。 学分数2 周学时4 基本内容： 本实验课程是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法的经典性、实用性。实验内容涉及了基因工程的主要过程，以含有载体质粒pBS的宿主菌DH5a为出发菌株。经实验中的碱法抽提后得到载体DNA，对其进行浓度及纯度的测定后，用EcoR I进行切割，通过琼脂糖凝胶电泳进行酶切图谱鉴定。利用提取的质粒转化CaCl2法制备的大肠杆菌感受态细胞。另外，从真核生物体内提取RNA并反转录成cDNA或直接从基因组中利用PCR的方法获取基因，并利用体外重组的方法构建新的克隆。此外，本课程还开设了RFLP和分子杂交检测技术实验。 基本要求: 本实验课在方法上，力求经典，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 教学方式： 教师讲解和强调实验原理、操作规范及注意事项，然后以两人一组的形式分组进行实验，教师与代教老师在实验过程中予以辅导，每项实验结果均须进行检测并有专人负责。 教学内容： 小量碱法提取质粒DNA DNA酶切及凝胶电泳 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 RNA的提取和cDNA合成 重组质粒的连接、转化及筛选 基因组DNA的提取 RFLP技术 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 分子杂交技术 参考教材： 盛小禹. 基因工程实验技术教程 复旦大学出版社 吴乃虎.基因工程原理 高等教育出版社 [美] J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南 科学出版社 编写：盛小禹 刘亚和 张腾 实验一 小量碱法提取质粒DNA 一，概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 二，材料、设备及试剂 一、材料 含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。 二、设备 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。 三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定