单链构象多态性分析.pptVIP

聚合酶链反应 ——单链构象多态性分析 PCR-SSCP 生物化工 刘静文 随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现，尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法、限制性片段长度多态性分析等已成为基因分析的有力工具。这些方法操作比较繁琐，局限性较大，要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。 简介 简介 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。 因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，该方法为单链构象多态性分析。 后将该方法用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。 简介 简介 应用方向： ◆检测基因点突变和短序列的缺失和插入 ◆检测人类引起遗传性疾病的研究 ◆基因的多态性分析和DNA定量分析 ◆监测PCR诊断实验中的交叉污染情况 ◆传染源的调查 将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 原理 刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。 流程示意 注意事项 1.用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP 分析。 2.游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率。 3.凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜或蔗糖等，有助于提高敏感性。 4.保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素。 5.凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶。 凝胶中的甘油 对聚合酶链反应-单链构象多态性技术的影响 方法：取5 μl PCR产物与等量加样缓冲液混匀，95℃变性3分钟后立即置冰上，取3～4 μl相同的样本在A、B二种条件下进行。A条件下凝胶中含5%甘油，B条件下凝胶中不含甘油，其他条件均为：9%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49∶1)，0.5×TBE作电泳缓冲液，恒流10 mA，同一室温下电泳6小时。 温度 对聚合酶链反应-单链构象多态性技术的影响 单链DNA的构象受温度的影响很大，操作温度是SSCP的关键参数之一。常规的平板凝胶电泳在低温(如4℃)或室温下进行，毛细管SSCP并不需要像平板电泳那么低的温度(如4℃)操作，14～18℃就足够了。 Andersen等对14个不同的等位基因的突变体分别用平板胶在5℃ 、20℃ 下，毛细管电泳在18℃、25℃、35℃下检测，结果表明，5℃的平板胶电泳和18℃的毛细管电泳可检测出所有突变，而2O℃的平板胶电泳只能检出9个突变，25℃和35℃的毛细管电泳分别只能检出11个和8个突变。 不同的样品、不同的缓冲溶液以及不同的聚合物成分都会有不同的最适温度。使用多个操作温度，灵敏度就会提高。单一温度下检测率在67%～100%的多个突变，若在多个温度的结合下检测，检出率都可达100%。另外还可采用温度梯度电泳。在低黏度3%羟乙基纤维素中，进行温度梯度电泳，突变检测的灵敏度可达100%。 又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP，方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后进行单链构象多态性分析加以明确。 甲基化敏感性单链构象分析 （MS-SSCA） 1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析； 2.能够对甲基化的等位基因进行半定量； 3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性。 1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低； 2.检测片段不宜过长。 优点 缺点 谢谢观看！