超现代实验技术离心技术.docVIP

超速离心技术 超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。离心技术可分为制备型和分析型两类。在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。离心技术的范围相当广泛。目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离-检测，全部实现自动化；最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。在实际工作中用的最多的还是制备型离心。本课程主要介绍制备型分离技术。 一、离心原理 离心技术是根据物质在离心力场中不同的行为来分离物质的。任何物体，当它做圆周运动时，都要经受一个向外的离心力（F）。离心力的大小，取决于离心转头的角速度（?，单位弧度/秒），和物质颗粒距离心轴的距离（r，单位厘米）。因此，离心力与角速度和距离的关系用方程式F=?2r表示。 （一）离心力 离心力（F）常用地心引力来表示。这时它指的是相对离心力（relative centrifugal force, RCF）。RCF又常以重力常数（g, 980厘米/秒2）的倍数来表示，所以： 为了使用方便，须用离心机的转数（即转数/分，以rpm表示，即revolutions per minute）来表达这个系数，可将弧度变成转速： 因此 从上式可知，只要知道离心机的rpm有离心管中某物质颗粒到离心转轴的中心垂直距离r，就能够计算这个颗粒所受的离心力。例如，一个离心转头，最大半径为9cm，转速为18000转/分，求离心转头最大离心力和最大相对离心力。 r = 9 cm ? = 2?18000rpm = 2 ? 3.1416 ? 18000 转/60秒 = 185 秒-1 最大离心力 = ?2r = （1885秒-1）2 ? 9厘米 =厘米/秒2 即相当于重力的32632倍，在这种条件下离心，样品沉降速度比重力场要大32632倍。 通常，超速离心时，用g来表示，在低速离心时，则用rpm表示。 为了知道转速（rpm）、旋转半径（r）离心管液柱中间到旋转轴中心的距离和离心力（单位为g）的关系，根据上面的方程式，Dole 和 Cotzias 制作了与转头速度和半径相对应的RCF的列线图（表1-1）。 （二）沉降系数 在离心力场作用下，物质颗粒以一定的速度向离心管底部移动，这个移动的速度可用下公式表示： v 为沉降速度。沉降速度与离心力场成正比，这一比例常数就是沉降系数。用S表示。 所谓沉降系数，就是在单位离心力场中颗粒沉降的速度。S的单位是秒，因为许多生物大分子的S值很小，所以定义10-13秒为一个沉降系数的单位。为了纪念超离心分析的创始入Svedberg，就把10-13秒这个数量级定为一个Svedberg单位，用S表示。 为了使沉降系数只表示样品本身的物理量，所以又规定了在20?C的纯水中所测得样品的沉降系数，并用S20,?表示，右下角的20表示温度，?表示纯水。由于许多生物大分子的沉降系数表现了浓度的依赖性，所以用浓度接近零的外推值来表示生物大分子的沉降系数，即S020,?，右上角的零表示浓度为零。 例如，溶菌酶的沉降系数为2.15?10-13秒，通常就叫做2.15S。过氧化氢酶的沉降系数为11.35?10-13秒，就称11.35S。大肠杆菌核蛋白体是70S，它是由两个亚基组成的，用超速离