原位杂交教学课件.ppt

杂交液： 4×SSC 50% 甲酰胺 1×Denhardt’s 5% 硫酸葡聚糖 0.5 mg/ml鲑精DNA 4℃保存； Buffer I： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base 150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl 用HCl调pH至7.5，高压灭菌，4℃保存； Buffer II： 0.5% Blocking agent Blocking agent 0.5 g Buffer I 100 ml 低温加热溶解，4℃保存一星期 试 剂 1、 Bruce,L.D.,et al.1993.Application of gene probes to detect a penaeid shrimp baculovirus in fixed tissue using in situ hybridization.Disease of Aquatic Organisms 17:215-221. 2、 Mari,J.,et al.1993.Partial cloning of the genome of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,an unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps;diagnosis of the disease using a specific probe.J.General Virology 74:2637-2643. 3、 Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual.Boehringer Mannheim Corporation, BiochemicalProducts, 9115 Hague Road,P.O.Box50414,Indianapolis, IN 46250,USA.pp.1-75. 4、 Poulos,B.T.,et al.1994.Use of non-radioactively labeled DNA probes for the detection of a baculovirus from Penaeus monodon by in situ hybridization on fixed tissue.J.Virological Methods 49:187-194. 参 考 文 献 ? Buffer II 配制——(0.5% Blocking agent ) 先将水浴锅调至60℃，称量Blocking agent ，加入相应量的Buffer I，在水浴锅中不断搅拌，直至溶解，大概需要30分钟，4 ℃保存。（20ml） 原 位 杂 交 原 理 原位杂交技术—原位杂交组织（或细胞）化学技术 是分子生物学和组织化学成功结合的产物。是以特定标记的已知序列核酸作为探针，与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行原位检测的方法（in situ hybridization）。 含互补序列的标记DNA或RNA片段（即探针），在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体，对杂交体进行检测。 由于原位杂交技术不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态结构，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态； 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便 。 优 点 用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位； 与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表