可溶性纤维连接蛋白对SGC-7901细胞中PKA活性的影响.pdf

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(5): 492-497 http ://www.cj 可溶性纤维连接蛋白对SGC-7901细胞中PKA活性 的影响 王忠诚　李永金 　陈永昌* (江苏大学基础医学与医学技术学院, 镇江2 12013) 摘要 本研究通过向SGC-7901细胞中加入可溶性纤维连接蛋白(fibronectin, FN)探讨可溶性 纤维连接蛋白对PKA活性的影响。实验采用蛋白印迹技术检测可溶性FN在不同浓度及作用时间 情况下对PKA Ca亚基表达水平以及PKA作用底物血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phos- phoprotein, VASP)磷酸化水平的影响; 采用免疫荧光技术检测可溶性FN对PKA作用底物p-VASP分 布的影响。结果显示, 在SGC-7901细胞中, 可溶性FN在0.5~8 mg/ml浓度区间内, 对PKA活性存在剂 量依赖性抑制效应; 选取1 mg/ml可溶性FN作用12 h 以后, 可溶性FN对PKA活性存在时间依赖性抑 制效应; 同时, 我们建立了能够稳定表达人甲状腺A激酶锚定蛋白(human thyroid AKAP, Ht31)肽段 的SGC细胞, Ht31破坏PKA锚定后, FN对PKA活性的抑制作用消失; 免疫荧光显示可溶性FN可以使 VASP磷酸化位置聚集于细胞边缘。因此, 我们认为在SGC-7901细胞中可溶性FN对PKA活性存在 抑制作用, 这种抑制效应与可溶性FN 的浓度及作用时间呈正比且取决于PKA 能否正常锚定; 可溶 性FN可以影响PKA活化位置。 关键词 可溶性纤维连接蛋白; PKA; p-VASP; Ht31 II R Ht31 在癌症以及肿瘤研究中, 整合素是重要的研究 型 亚基非常重要。包含这一肽段的 蛋白对 G RII有高度亲和力, 本文中用以阻断PKA 的正常锚定, 对象。在受整合素影响的众多信号通路中, 小 蛋 RhoA A(protein kinase A, PKA) PKA FN PKA 白 、蛋白激酶 介导的 探究破坏 锚定后 对 活性的影响。 信号通路在肿瘤迁移过程中作用十分显著[1] 。但是 整合素作为一类重要的细胞膜表面糖蛋白受体, 其 1 材料与方法 发挥生物学作用需要与配体结合。之前的研究中我 1.1 材料 们发现, 整合素 (fibronectin, 人胃癌细胞株SGC-7901 由上海生物化学与细胞 a5b1 的配体纤维连接蛋白 FN) Fibronectin Sigma 以溶解形式存在时可以与整合素a5b1结合并诱 生物学研究所提供。 购自 公司, 用 导RhoA介导的信号转导[2] 。同时, RhoA介导的信号 PBS配制成实验所需的浓度。小牛血清和DMEM细 PKA GIBCO Am- 通路与 介导的信号通路间存在拮抗效应, 上述 胞培养基购自美国 公司, 胰蛋白酶购自 FN PKA resco p-VASP Ser157 PKA C 过程中 对 介导的信号通路产生何种影响报