酶工程制药专题知识讲座课件.ppt

抗体酶制备方法 （1）稳定过渡态法：用类似于反应过渡态的小分子作为半抗原，产生相应的抗体而获得。 （2）抗体与半抗原互补法：利用抗体-半抗原互补性产生抗体酶，通过半抗原的优化设计使之正确模仿过渡态的几何结构及所有的反应键，从而产生高活力的抗体酶。 （3）熵阱法：利用抗体结合能克服反应熵垒来设计半抗原。 利用过渡态类似物制备抗体酶 （4）多底物类似法：将酶催化反应的辅因子引入到抗体结合部位，产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体 （5）抗体结合部位修饰法：将抗体的结合部位引入催化基团 （6）抗体库法：用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。 对于任何分子，几乎都可以通过免疫系统产生相应的抗体，而且专一性很强，抗体的这种多样性标志着抗体酶的应用潜力是巨大的。 四、基因工程酶的构建 1、酶基因的克隆和表达 重组DNA技术克隆各种天然酶的基因，在微生物中表达，筛选出高产菌株，可以通过发酵大量生产所需要的酶。 2、酶基因的遗传修饰 人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子中某个或几个氨基酸，不仅改变酶的结构，而且改变拜的催化活力，专一性及稳定性。 * * 酶工程制药专题知识讲座 二、模拟酶的理论基础 1. 模拟酶的酶学基础 Pauling稳定过渡态理论：酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快反应速度。 模拟酶要和酶一样，能够在结合底物过程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。 2. 主-客体化学和超分子化学 主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的客间及电子排列的互补。 超分子的形成源于底受和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，超分子兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。 主-客体化学和超分子化学已经成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。 三、模拟酶的分类 根据Kirby分类法，模拟酶可分为： 单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。 机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和生产。 单纯合成的酶样化合物：一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。 按照模拟酶的属性，可分为： 主-客体酶（环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等） 胶束酶 肽酶 半合成酶 分子印迹酶 1. 主 - 客体酶模型 优良的模拟酶—环糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。 由几个D-(+)-吡喃葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。 环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。 除了环糊精等天然存在的宿主酶模型外，人们还合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体来构建酶模型。 2.胶束模拟酶 胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚，如果再在胶束上共价或非共价结合了催化基团和一些辅酶后，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酸。 目前比较重要的胶束酶模型有： 模拟水解酶的胶束酶模型 辅酶的胶束酶模型 金属胶束酶模型 3.肽酶 肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。 4.半合成酶 以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。 5. 印迹酶 分子印迹：制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程。该特定分子称为印迹分子或模板。 （1）分子印迹的原理 分子印迹的过程： 1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。 2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。 3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。 （2）印迹分子与单体相互作用的类型 印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。 非共价分子印迹：首先是印迹分子与功能单位相混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物，最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别部位。 共价 分子印迹：印迹分子与功能基团形成共价键，在与交联剂发生共聚合后，用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去。 （3）分子印迹酶 通过分子印迹技术