血红蛋白的提取和分离试用版课件.ppt

取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时 (5)透析 除去样品中分子量较小的杂质 ①过程 ②透析目的 利用透析袋透析 2、凝胶色谱 （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底 注意事项： ⑤安装其他附属结构 ③顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B、代表意义： 交联葡聚糖凝胶（G-75） 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ②凝胶的前处理 ③凝胶色谱柱的装填方法 A、固定 B、装填 将色谱柱处置固定在支架上 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 血红蛋白的提取和分离试用版 (一）蛋白质 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物 2、组成元素 C、H、O、N 一、基础知识 1、含量 3、相对分子质量 高分子化合物 4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 R H C COOH NH2 6、氨基酸连接方式 脱水缩合 8、分子结构 7、肽键 CO NH 氨基酸 肽链 蛋白质 脱水缩合 盘曲折叠 （一条或者多条） 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 9、蛋白质结构的多样性 1、分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、 蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质 (二）蛋白质的提取 （三） 分离蛋白质的方法 ②实例：葡聚糖、琼脂糖 （2）凝胶 1、凝胶色谱法（别名分配色谱法） ①性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道 （1）概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离 ①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道 （3）凝胶色谱法的原理—分子筛效应 ③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 ②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢 （5）具体过程 蛋白质分子量的大小 （4）依据的特性 （四）缓冲溶液 1、概念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变 2、作用 4、缓冲溶液的组分分类 ①弱酸和弱酸盐组合 H2CO3 NaHCO3 CH3COOH CH3COONa 3、缓冲溶液的配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液 ②弱碱和弱碱盐 NH4OH NH4CL ③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 NaH2PO4 Na2HPO4 KH2PO4 K2HPO4 如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？ （五） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子