第二章细胞破碎与提取要点.pptVIP

第二章 蛋白质的制备 ---细胞破碎与萃取;第一节 蛋白质制备总则; 工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析;三、确立有效成分的测定方法;三、确立有效成分的测定方法;3、根据蛋白质性质确立分离方法;四、蛋白质的制备流程：;首先：;第二节 材料的选择、预处理与保存;微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。;（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原 料，如发酵液、提取液等。;第三节 细胞破碎;1、材料细胞的特性 ;2、目的物的特性;㈠ 机械法;㈡ 物理法;3．反复冻融法：-15℃～-20℃， 适用：动物材料 将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 ;㈢．化学法 ;（四）酶解法 ;例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累;包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 ;包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。;重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆???为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包涵体（inclusion bodies IBs)。;2、包含体的构成;3、包含体特点:;几种常见的工艺路线（一）;路线1 的特点;几种常见的工艺路线（二）;路线2 的特点;几种常见的工艺路线（三）; 路线3 特点：;一、概述;液-固萃取;概念：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为固-液萃取，也称浸取或浸出。 ;用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取;溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生 了一系列新型分离技术： 超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction） 反胶团萃取（Reversed micelle extraction） 双水相萃取技术（Partition of two aqueous phase system ）;根据萃取原理分类的 基本概念;2、萃取技术的操作特点;3、萃取需要考虑下列问题;把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。 物质的溶解和相似相溶原理。 萃取是通过溶质在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。;影响萃取操作的因素：;d．乳化;乳化剂类型; （亲憎平衡值）;乳化与去乳化;破乳的方法：;3.过滤破乳;5.电解质破乳;三 反胶束萃取 （反胶团萃取）;1、基本术语;反胶束(reverse micelles): 若向有机溶剂中加入一定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。 微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。 ;;2 反胶束的溶解作用;2 反胶束的溶解作用;2、反胶束的溶解作用;3、反胶束萃取的影响因素;2)盐浓度 ;3)、盐离子的种类;4) 蛋白质分子量M;5)、表面活性剂S A 种类 B [S];6) 助表面活性剂 ;4、应用;2) 胞内酶的提取;四、 超临界流体萃取;简介：;超临界流体的发展;（一）、超临界流体的萃取的原理;超临界流体(SCF);2. 超临界流体的特征;超临界流体的性质;超临界流体的主要特性;溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。;可作为超临界流体的物质： 二氧化碳、 一氧化亚氮、 六氟化硫、 乙烷、 庚烷、 氨等。;常用的流体介质;3. 超临界流体萃取特点(优点);4.