试论微生物蛋白酶.docVIP

PAGE PAGE 1 试论微生物蛋白酶 中文摘要：目前低温蛋白酶的研究己经引起世界各国学者们的关注。随着对低温蛋白酶研究的深入，将会有更多行业应用低温蛋白酶。蛋白酶已广泛应用在 皮革、 毛皮、 丝绸、 医药、 食品、 酿造等方面。皮革工业的 脱毛和 软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。 关键词： 低温蛋白酶、测定、提取、纯化、应用前景 目录 一、中文摘要、关键词…………………………………………………2 二、目录…………………………………………………………………3 三、论文正文……………………………………………………………4 （1）第一章 蛋白酶的提取方法……………………………………4 （2）第二章 蛋白酶的纯化方法……………………………………5 （3）第三章 低温中温高温蛋白酶以及其作用……………………6 （4）第四章 蛋白酶的检测方法…………………………………8 （5）第五章 低温蛋白酶的应用前景，存在的问题………………9 四、参考文献……………………………………………………………10 蛋白酶是 水解蛋白质 肽键的一类 酶的总称。按其水解 多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内 肽酶将 蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的月示和 胨。外肽酶从蛋白质分子的游离 氨基或 羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出 氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其 活性中心和最适 pH值，又可将蛋白酶分为 丝氨酸蛋白酶、 巯基蛋白酶、 金属蛋白酶和 天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为 酸性蛋白酶、 中性蛋白酶和 碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于 动物内脏、 植物茎叶、果实和 微生物中。微生物蛋白酶，主要由 霉菌、 细菌，其次由 酵母、 放线菌生产。 催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有 胃蛋白酶、 胰蛋白酶、 组织蛋白酶、 木瓜蛋白酶和 枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解 碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物 消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用 枯草杆菌、栖土曲霉等 微生物发酵制备。 第一章 蛋白酶的提取方法 目前国内对蛋白酶的分离技术主要是应用有机溶剂提取法、盐析法、或底物亲和法进行粗分离后, 得到混合的胃酶(包括胃蛋白酶A、B、C、D ), 但应用到生产中的只有有机溶剂提取法和盐析法。国外则对此研究较早, 主要集中在20世纪六七十年代, 经盐析得到了商业结晶胃蛋白酶。 1.1 有机溶剂沉淀法 有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩, 通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮。此种方法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异而实现分离的[ 1.2 盐析法 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液, 中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时, 中性盐加入蛋白质溶液后, 由于离子强度发生改变, 蛋白质表面电荷被大量中和, 更加导致蛋白溶解度降低, 使蛋白质分子之间聚集而沉淀[ 4 1.3 底物亲和法 底物亲合法是利用酶(胃蛋白酶) 与其底物(酪蛋白) 的亲和性, 从胃黏膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2??5的乳酸缓冲液中充分结合, 然后调pH 至4??0 (底物的等电点) 沉淀底物和酶的结合物, 随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中, 添加低浓度的SDS将底物和酶分离,得到酶- SDS复合物, 再进一步分离纯化。陈躬端( 2001) 成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离, 得率大约为30%。与传统的分离方法比较, 此法具有简单高效的优点, 为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用, 同时具有较高的特异性 第二章 蛋白酶的纯化方法 [ 1.1 凝胶过滤 凝胶过滤主要是利用凝胶的多孔性, 当样品溶液通过凝胶柱时相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔, 而只是沿着凝胶颗粒的孔隙随着溶剂首先流出层析柱[ 1.2 离子交换层析 离子交换法一直以来都是酶生产所常用的方法。它是一项利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术。具有简便、高效、成本低, 且可自动化连续操作的优点 1.3 双重层析配合法 为了获得高活力的胃蛋白酶, 还常将两种层析方法配合使用。张继平( 2004) 对