第四章沉淀分离法..pptVIP

固相析出分离技术;晶体：有规则 无定形沉淀：无规则;第四章沉淀分离法 ; 沉淀法： 利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 具有浓缩和分离的双重作用。 在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。;盐析沉淀法 有机溶剂沉淀 等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法; 一、盐析沉淀法 ; （一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。; 蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团; 当向蛋白质溶液中加入中性盐时：;H+; 蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。;1 2 3 4 5 6; （二）无机盐的选择 ;0 20 40 60 80 100;盐析效果：阴离子 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。;无机盐可按两种方式加入溶液中：; （三）影响盐析的各种因素 ;1.无机盐加入量的影响;0 2 4 6 8 10; 对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。;蛋白质沉淀的速度可用 - — 对盐饱和度（P）作图来表示：;2.蛋白质浓度的影响;3.温度的影响; 4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的pI附近。 耗盐少，蛋白质收率也高; 5.操作方式的影响; 6.盐析法的优缺点; （2）缺点： ① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上 ; 二、有机溶剂沉淀法 ; （一）基本原理 ; 常用于生物大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的; （二）影响沉淀效果的因素 ;1.温度的影响; 整个操作过程应在低温下进行。 具体操作时： ① 将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷： 蛋白质溶液冷却到0oC左右， 有机溶剂预冷到-10oC以下 ② 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时应不断搅拌、少量多次加入。 ③ 使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机溶剂与目的物的接触。; 温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，10-15oC。;2.pH的影响;3.无机盐的离子强度;4.金属离子;5.有机溶剂沉淀法的优缺点;（2）缺点： ① 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限； ② 采用大量有机溶剂，成本较高。 为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。 ③ 有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。;等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法; 1.等电点沉淀法 两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。 不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。; 只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。 对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。 往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。 采用该法时必须注意： 溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。; 等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。 如在工业上生产胰岛素时： 先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。; 2.成盐沉淀法 ; （1）金属离子沉淀法 许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。; 分离出沉淀物后，