生物技术大实验.docVIP

PAGE PAGE 2 生 物 技 术 大 实 验 编者：岳强 包英华 陈燕飞 刘静华 韶 关 学 院 英 东 生 物 工 程 学 院 二OO六年二月十五日 目 录 第一部分 常用分子生物学实验技术及原理 第一章 核酸的提取和纯化 第二章 电泳 第三章 分子生物学中常用的工具酶 第四章 核酸探针的分子标记 第五章 核酸的分子杂交 第六章 DNA的序列测定 第七章 PCR原理及其应用 第八章 重组DNA技术基本原理 第九章 生物信息学简介 第二部分 生物技术综合实验室简介 第一章 实验室的基本要求和注意事项 第二章 实验室常规仪器设施及基本操作简训 第三部分 实验内容 1．目的基因的获得和重组载体的构建 实验一 真核生物总RNA的提取、分离和纯化 实验二 PCR扩增制备目的基因 实验三 目的基因片段与载体连接 实验四 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断 2．感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定 实验五 感受态菌的制备 实验六 细菌转化 实验七 重组菌株的筛选和鉴定 3．质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定 实验八 载体质粒DNA的小量制备 实验九 载体质粒DNA的酶切 实验十 酶切产物电泳鉴定 4．目的基因的表达与检测 实验十一 酸性磷酸酯酶的动力学分析 实验十二 细胞色素C的提取及测定 附录 分子生物学常用试剂、溶液和缓冲液 课 程 简 介 《生物技术大实验》是生物技术专业（基础生物技术方向）第六学期开设的一门专业限选课，内容分为：常用分子生物学实验技术及原理（含理论和多媒体内容，30学时）；实验90学时；机动4学时，共124个学时，7学分。 生物技术大实验主要包括对分子生物学、基因工程和生物工程下游技术等三门学科的实验技能训练和培养，这三门都是当今生物学中应用较广的实验性学科，因此对学生进行相关实验操作能力的培养时十分重要而有益的。针对生物技术专业的特点，结合实验室设备和资源的具体情况，决定开设的实验由三个学科中较常见的经典实验，如生物大分子的抽提及检验、分子克隆等组成。这些实验既可加深学生对理论知识的理解，又可培养学生的动手操作能力，还能大大提高学生对这些热门学科的兴趣。 本实验课程按照四年制生物技术专业本科生的教学计划及教学培养目标设置，同时结合我校实际，符合课程要求。 实验学时分配 实验内容 学时 分子生物学实验基本操作简训 2 实验一 真核生物总RNA的提取、分离和纯化 8 实验二 PCR扩增制备目的基因 6 实验三 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断 6 实验四 目的基因片段与载体连接 12 实验五 感受态菌的制备 20 实验六 细菌转化 6 实验七 重组菌株的筛选和鉴定 20 实验八 载体质粒DNA的小量制备 4 实验九 载体质粒DNA的酶切 4 实验十 酶切产物电泳鉴定 2 合计 90 实验十一 酸性磷酸酯酶的动力学分析* 2 实验十二 细胞色素C的提取及测定* 2 注：*为选做实验 第一部分：理论内容 第一章 核酸的分离与提取 1．概述 1.1 提取的含义 提取是指在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质充分释放到溶剂中的过程.又称为抽提或萃取。常用的溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱或甘油等较缓和的试剂。影响提取的主要因素:①提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)：如极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在 pI时，溶解度最少。②温度:一般温度升高溶解度增大 ③溶液的粘度 ④扩散速度； ⑤扩散面积。 1.2核酸的特点 核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DNA），在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些嗜菌体DNA有时为单链环状分子，RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子，不同类型的RNA分子可以具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有poly(A)结构，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中，RNA以rRNA的数量最多（80％-85%），tRNA及核内小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各异。 总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而RNA的分子量与生物进化无明显关系。 1.3分离纯化核酸总的原则 核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去