CD34+ 细胞及分离方法.pptVIP

CD34+ 细胞分离及其体外扩增 CD34+细胞 CD34+细胞是造血干细胞的表面标志分子。 细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质量为110-120kD的高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细胞以及少量内皮细胞表面。 CD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中都有存在。用常规方法一般难以有效分离。原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低，抗CD34+的亲和力低，表达CD34+抗原的细胞存在于一个不均一的本底细胞群中，且数量极少。 分离CD34+细胞的方法 荧光激活细胞分选 免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析法；免疫磁珠法） 细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计数流式法） 流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获得高纯度的CD34+细胞，但是由于得量较少，受无菌实验条件等方面的限制，所以应用较少。 细胞物理参数系统分离CD34+细胞得率较低，而且需要提供足够的细胞量。 目前常用于分离CD34+细胞的方法主要是免疫吸附法（ systems based on immunoadsorption)。 尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads)的方法应用更为广泛。 CD34+细胞分离方法比较 免疫磁珠吸附分离CD34+细胞 利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血干细胞库等实验。 实验材料： 1.脐带血，外周血及骨髓标本； 2.PBS缓冲溶液； 3.10%BSA； 4.10mmol/LEDTA； 5.淋巴细胞分离液； 6.MACS磁性分离仪； 7.MACS分离试剂盒； 操作步骤 1. 配制含1%BSA和5mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液。 2. 利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞； 3.将1*108个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul； 4. 将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞； 5.将分离柱移出磁场，加1ml 缓冲液加压洗脱，收集CD34+细胞。 6.用免疫细胞化学和FACS分析CD34+细胞纯度 分离结果 分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细胞的1-4%，外周血仅为0.2% 。 分离后， CD34+细胞可达95-99%。CD34+抗原组则99.6%的细胞为CD34-细胞。 回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的CD34+细胞纯度和回收率均较高。 体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞的比较 目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细胞（MNC）和CD34+富集细胞，对比考察这两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等特性。 王斌，康自珍，迟占有等。体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞。 生物工程学报，2002,5(18),343-347. 方法 1.Ficoll 密度梯度离心收集单个核细胞; 2.免疫磁珠分离纯化CD34+细胞. 3.MNC接种密度为5*105 cells/ml. CD34+细胞为2*104 cells/ml于24孔板，每周取样计数，集落检测和流式细胞分析. 结果 造血干/祖细胞集落密度分析 造血干/祖细胞总集落扩增分析 分析可以看出，MNC的集落在培养过程中其集落密度和集落数量都曾实现了增高。 而CD34+富集细胞的集落只实现了数量上的扩增，单个细胞所形成的集落数并没有明显的增高过程。 小结 经过体外培养，培养前期MNC的CD34-可能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有促进作用； 而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说明在培养中存在大量分化。 讨论与总结 MACS技术在实验室处理低细胞量情况下，是目前纯化CD34+细胞较好的方法。 CD34+细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培养，5周内即可以得到更多的CFU-GM形成细胞和CD34+细胞。 CD34+细胞的大量扩增为造血干/祖细胞的定向诱导分化提供了有利条件。 * * 经济 快 低 易 低 细胞物理特性分离 经济 快 高 易 大 免疫磁珠吸附分离 高 慢 高 难 少 荧光激活细胞计数 条件 分离速度 细胞纯度 难易程度 细胞得率 分离方法 脐血CD34+细胞的分离结果 MNC扩增到第28天，细胞总数开始呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。在前4周中，MNC的扩增倍数远低于CD34+富集细胞 细胞