大提质粒及注意事项.docVIP

大抽protocol（200ml） 1：4度，6000rpm，10min，离心菌。2：4ml溶液1（见分子 克隆）重悬。3：8ml溶液2（0.2MNaOH，1%SDS）裂解，轻颠5-10次，室温10min。4：4ml溶液3中和，轻颠5-10次，冰上15分钟。5：4度，20000g，离心45min。6：上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温10min，离心室温12000rpm，15min。7：75%乙醇刷洗一遍，离心10min。8：3ml水溶解充分（很重要）。9：加入3ml冰预冷的5M Licl混匀，离心4度12000rpm，10min。10：倒出上清加入等体积异丙醇充分混匀静放10min，离心室温12000rpm，10min。11：75%乙醇刷洗一遍，离心10min，晾干（重要）。12：500微升含RNAase（300微克/ml）溶解，37度放60min。13：酚：氯仿（1：1）抽提一次，若不干净再抽一次（很重要）。14：加入2倍体积无水乙醇再加入1/10体积乙酸钠充分混匀，室温沉淀15min，离心12000rpm，室温10min。15：1ml水溶解沉淀（重要），再加入0.5mlPEG-Mgcl2混匀，室温静放20min，离心室温12000rpm，20min。16：沉淀0.5ml75%乙醇洗两遍，4度离心20000g ，5min。17：吸去乙醇晾干（重要）。18：用100-500微升水溶解质粒，测OD值，然后分装。 注意：加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。 加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次 离心管。2.加入溶液3后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。3.在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是200～ 300 微升，以减少DNA的损失。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学 试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳 的溶解细胞的 试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让 基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下 基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然 基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。每个