高效液相色谱-HPLC.pptVIP

* * * k′ 是样品与填料作用强度的直接量度 保留因子(k′):保留能力的量度 α是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述 分离因子(α):峰分离程度的量度 理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度 用于评价色谱柱的性能(中国2015版药典) 理论塔板数(N):分离效率的量度 色谱峰对称性的测量方法 中国药典要求对仪器进行适用性试验, 即用规定的对照品溶液或系统适应性溶液对色谱系统进行试验和调整,要达到规定的要求
色谱系统的适应性实验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子四个指标
要求:?理论塔板数N: 大于规定值(按半峰宽法计算)?分离度R: 应大于1.5?重复性: 连续进样5次,峰面积的相对标准偏差不大于2.0%?拖尾因子T: 应在0.95-1.05之间
中国药典对系统适用性的规定 在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物 液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量 液相色谱法定量的依据是:被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比 液相色谱定量分析原理 用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份 鉴别需定量的色谱峰(定性) 定性鉴别每个要定量的色谱峰–首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间(Rt)–通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份 色谱定性是用与标样比较保留时间的方法 因此要明确：–保留时间相同，可能是同样的组份–保留时间不同，肯定不是同样的组份 鉴别需定量的色谱峰(定性) 标准加入法 同时用其它方法 1其它色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱柱) 2其它检测器 o PDA, 光谱图比较、谱库检索 o MS，质谱图解析、谱库检索 3其它仪器方法 进一步的确认(定性) 确认定量峰的一致性 PDA 纯度角原理 PDA 纯度角测定结果 标准曲线法,分为外标法和内标法:-外标法:液相色谱中用得最多-内标法–准确，但是麻烦–在标准方法中用得最多 常用的定量方法 液相色谱定量分析的步骤 外标法定量(1) 外标法定量(2) 外标法定量(3) 外 标 法 按 各 品 种 项 下 的 规 定 ，精 密 称 （量 ） 取对照品和供试品，配 制 成 溶 液 ，分 别 精 密 取 一 定 量 ，进 样 ，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高），按 下 式 计 算 含 量 ： 外 标 法中国药典2015 内标法定量(1) 内标法定量(2) 内标法定量(3) 内标法定量(4) 测 定 杂 质 含 量 时 ，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在 建 立 方 法 时 ，按各品种项下的规定，精 密 称 （量 )取待测 物对照品和参比物质对照品各适量，配制待测物校 正因子的溶 液 ，进 样 ，记录色谱图，按下式计算 待测物的校正因子  加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 也 可 精 密 称 （量 ） 取 主 成 分 对 照 品 和 杂 质 对 照 品 各 适量 ，分 别 配 制 成 不 同 浓 度 的 溶 液 ，进 样 ，记 录 色 谱 图 ，绘制主 成 分浓 度 和 杂质 浓度 对其 峰面 积的 回归 曲线 ，以主成分回归 直 线斜 率与 杂质 回归 直线 斜率 的比 计算 校正 因 子 。 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 除 另 有 规 定 外 ，通 常 含 量 低 于 0 .5 % 的 杂 质 ，峰 面 积 的相 对标 准偏 差（ RSD)应 小 于 10% ; 含 量 在 0. 5% ?2% 的 杂 质 ，峰 面 积 的 RSD应 小 于 5 % ; 含 量 大 于 2% 的杂质 ，峰 面 积 的 RSD应 小 于 2 %。 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照精密度 测 定 杂质 含量时 ，若 无 法 获 得 待 测 杂 质 的 校 正 因 子 ，或 校 正 因 子 可 以 忽略 ，也 可 采 用 不 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 法 。 不加校正因子的主成分自身对照法 按 各 品 种 项 下 的 规 定 ，配制供试品溶 液 ，取 一 定 量 进 样 ，记 录 色 谱 图 。测量各峰的面积和色谱图 上 除 溶 剂 峰以 外的 总色 谱峰 面 积 ，计算各峰面积占总峰面积 的 百 分 率 。用 于 杂 质 检 查 时 ，由 于 仪 器 响 应 的 线 性 限 制 ，峰 面 积 归 一 化 法 一 般不 宜用 于 微 量杂 质 的 检 査 。 面 积 归 一 化 液相色谱定量的精密度 精密度的衡量 准