第10章外源基因表达和基因工程药物.pptVIP

大肠杆菌 载体 0℃CaCl2 选择性培养基上培养 筛选阳性克隆 得到大量目的基因 CaCl2法 选择性培养基上培养 3.电转化法 在高压电脉冲作用下在细胞膜上形成微小疏水孔洞。促使细胞吸收介质中的DNA进入细胞质。 用途广泛，植物、动物细胞。 4.重组DNA分子导入植物细胞 ● 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 叶盘转化法 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌。能感染植物受伤部位，诱发植物产生冠瘿瘤。 根癌农杆菌细胞中含有Ti 质粒。在Ti 质粒上有一段T-DNA，即转移-DNA (transfer-DNA) 。 根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA 插入到植物基因组中。因此，根癌农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 土壤农杆菌转化植物细胞： 含外源基因的Ti质粒转化到土壤农杆菌 取植物组织叶片，在培养基上生长，感染已转化的农杆菌 诱导生根发芽，获得转基因植株 5、其他方法 ●显微注射技术 ●磷酸钙转染法 ●基因枪技术 基因枪法：使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。 显微注射法： 在显微镜下，将DNA用玻璃显微注射器直接注射入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧 脂质体载体法：类脂经 机械搅拌、超声波等处 理，形成双脂层小囊 泡，将外源DNA包装在 脂质体的内部，在融合 剂如PEG或植物凝集素 的作用下，靶细胞和装 载DNA的脂质体融合， 通过胞吞作用将脂质体 摄入胞内。 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 四、重组体的鉴定和分析 含有重组DNA分子与不含重组DNA分子的受体细胞 期待的重组DNA分子与非期待的重组DNA分子 1、利用载体的选择性标记筛选 （1）抗药性筛选 （2）插入失活筛选法 （3）显色互补筛选法 质粒载体的一般结构 Ampr Terr 插入失活: 例1 在Tetr中插入目的基因 在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。 (插入失活法) 抗药性标记选择 X-gal ?-半乳糖苷酶 Lac-Z基因 IPTG 蓝色产物 如：pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal（ ?半乳糖苷酶的底物）便会被?半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒 X-gal 蓝色化合物 ?-半乳糖苷酶 Lac-Z基因 蓝白斑筛选 2.酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 （1）? 插入片段大小的鉴定 （2） 插入片段方向性的鉴定 Restriction mapping 酶切 克隆基因的检查和鉴定方法 凝胶电泳(gel electrophoresis) 自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(po1yacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法 。 DNA在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，把DNA分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 核酸的凝胶电泳基本原理： 在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小、所带净电荷多少和构型。 2.表达载体(expressing vector) 特点：在克隆载体的基础上，携带转录和翻译所需的DNA序列，即转录翻译调控系统的起始、终止序列等。如： 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 转录终止序列 翻译起始区：核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)，起始密码子(ATG)和SD序列 3.噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒的总称。其结构比质粒要复杂，噬菌体的DNA除了复制起点以外，还有编码外壳蛋白质的基因。 用作克隆载体的噬菌体有：λ噬菌体，M13噬菌体。 λ噬