基因表达沉默技术.ppt

* 机体固有同源重组现象的应用使建立基因敲除动物最终成为可能。 * 怎样筛选实现了同源重组的ES细胞呢？ 胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。 * 马里奥·卡佩基(Mario .Capecchi),马丁·埃文斯(Martin J.Evans)和奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)从各自不同的研究角度使这项技术成为可能 * 胸腺嘧啶激酶 * 知识回顾Knowledge Review * silence * 教学内容……. * 回顾一下什么叫RNAi?参与RNAi过程的…… * 再来回顾一下RNAi的发现历史。1995 年，康奈尔大学Su Guo 博士，在试图利用反义RNA 技术阻断秀丽线虫par-1 基因时，发现了实验对照正义 RNA 也能阻断par-1基因的表达。 困惑…… * 1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello 解释了困惑 他们将……. Guo等人与诺贝尔奖擦肩而过，而Fire和Mello抓住困惑不放，也就抓住了成功。 * 通过实验阐明了这一反常现象：将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽线虫比单独注射反义RNA诱导基因沉默效率高10倍。由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平(Fire等，1998)。 * 再来简单回顾一下RNAi作用机制 * 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗研究领域。在座各位十有八九也要进行siRNA实验设计。 怎样进行siRNA设计？ 设计的siRNA是什么样？看看天然siRNA分子是什么样，就会一目了然。 长度 悬端 * 找到ADAM17基因的描述 * CDS 78..2552 我们进行siRNA设计的靶序列 * 科研工作者的经验总结：学者根据经验建议：寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点，较易取得干扰成功 。 * 瞬时；长期：构建siRNA针核表达载体-转染细胞-稳定表达克隆 谁来启动siRNA表达呢？ * 如何进行siRNA基因设计和克隆？举例说明 反向互补序列 * 工作不工作，要导入细胞内才知道。 * 导入细胞后，接下来做什么来验证siRNA？ 最有说服力的是…… * 实际工作中，合成or 构建载体？ * siRNA实验设计…… * 形成双链抑制翻译………;反义mRNA * 技术自出现以来…..针对癌基因的反义核酸文章….. * 核酸在体内易被降解，研究人员……. * the first generation phosphorothioate backbone modification 磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子。PS DNA ON的主要缺点是能与一些蛋白结合，这可以引起细胞毒性。另外一个缺点是与互补RNA的亲和性会稍微降低 * 第二代寡聚核苷酸在核糖的2位置含有烷基修饰。2-O-甲基和2-O-乙基是这类修饰的两个重要成员。具有这种修饰的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，并且与互补RNA的亲和性也得到了稍微提高。然而这些有利的性质被2-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA这个缺点所抵消 * 感兴趣的同学可上网 反义核酸药物上市？ * 每年 * 1个死亡病例和1个产生严重中枢神经系统副作用的病例，公司决定暂时中止Tys abri的销售 * * 核酶可特异性地切割靶RNA序列的特性。被科学家拿来进行基因功能和基因治疗研究。 * 以锤头状核酶为例，学习如何设计针对靶mRNA的人工核酶 * 用于在动物水平研究基因功能….. * 对高度分化的细胞进行基因敲除，这些高度分化的细胞没有发育成组织器官或个体的能力；而对ES细胞进行基因敲除，这些全能性则有发育成组织器官或个体的能力，由此也就可以得到基因敲除的动物。 目的也是为了在动物水平进行基因功能研究。 * 第二节 反义核酸技术 * 1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288. 历史由来 * 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和反义RNA。 基本概念 反义RNA技术 反义DNA技术