Ⅱ型猪圆环病毒ORF2 ORF3基因切的克隆表达与潜在应用分析.docx

山东大学博士学位论文II型猪圆环病毒ORF2、ORF3基因的克隆表达 山东大学博士学位论文 II型猪圆环病毒ORF2、ORF3基因的克隆表达 与潜在应用研究 摘 要 II型猪圆环病毒(Porcille corcirvims type II，PCV2)可引起断奶仔猪多系 统衰竭综合征、猪皮炎肾炎综合征、先天性震颤等多种疾病，临床表 现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疸和腹泻等症状，急性暴发 猪群的死亡率可高达50％，对世界养猪业造成了极大的危害。目前，尚无有效预 防和治疗措施，这与还没有有效的疫苗以及病毒的基础研究尚不清楚有关。本文 对该病毒的衣壳蛋白(抗原蛋白)编码基因DJ弦和新发现的o,f3基因进行了克隆 表达与应用研究，以期为研究防治PCV2有效疫苗和PCV2致病机理奠定理论基 础。 本论文分别从山东省6个地区的6份阳性病料中PCR扩增off2基因和orf3基 因。以D啦为靶基因进行6个毒株的分子流行病学分析。序列同源性分析表明，6 个毒株之间的核苷酸序列同源性为93．3～99．7％，氨基酸序列同源性为92．3-100％； 氨基酸序列存在2个高变区，分别位于序列的5790位和190--220位的区域，其中 57--90区域位于结构蛋白的免疫反应活性区；遗传进化分析显示，SDI、SD III、 SD V、SD VI与法国株(AY322000)和中国农大株(EF524521)共同形成一群， 可能起源于共同的祖先；SD II、SD IV与其他7株PCV2毒株共同形成另一大群， 与海南株(AY556476)的亲缘关系最近；结合GenBank报道的山东境内分离的 1 3个PCV2毒株的off2基因序列进行RFLP分析，可将山东省PCV2流行毒株分为 CHN．2H型、CHN．2F型、CHN．2I型和两种新的基因型，命名为CHN．2J型和 CHN．2K型。其中，CHN．2H型所占比例最高，为优势基因型，是引起山东省规 模化猪场暴发PCV2疾病的主要基因型，也与我国PCV2流行的优势基因型相一 致，因此我们以此基因型为主研制防治PCV2的疫苗。 乳酸菌在食品发酵业具有悠久的应用历史，是公认的安全(GRAS)细菌。 以乳酸菌作为活疫苗载体，靶向表达医用蛋白和抗原物质，已成为医药研究领域 的热点之一。为研制开发一种更为方便、安全、有效的12／]艮PCV2活疫苗，我们 构建了重组PCV2衣壳蛋白的乳球菌分泌型活疫苗载体，将去核定位信号的D啦 山东大学博士学位论文基因(dCap)克隆入E 山东大学博士学位论文 基因(dCap)克隆入E coli／L．1actis穿梭表达载体pSEC和pSEC：LEISS。 SDS．PAGE和Western blot分析证明dCap蛋白在pSEC．dCap重组菌和pSEC： LEISS．dCap重组菌的菌体内都得到诱导表达，而且pSEC：LEISS-dCap重组菌实 现了蛋白的分泌表达。通过对诱导温度、诱导OD值、nisin诱导浓度和诱导时间 四个因素的条件优化，确定pSEC：LEISS．dCap重组菌最佳的诱导表达条件为： 在OD600=1．叽1．2时加入终浓度为10-,12ng／mlI拘nisin，180C诱导6小时，分泌的 dCap蛋白量可达1．2mg／L，比优化前提高2倍。 作为乳酸菌口服活疫苗制品，能否顺利通过胃肠道环境并存活于肠道，同时 将表达的抗原呈递到免疫相关部位，是其能够发挥功效的的关键环节。为了衡量 构建的重组乳球菌NZ9000／pSEC：LEISS．dCap的疫苗应用潜力，我们对其进行了 体外模拟胃肠道环境的耐受力检测和小鼠活体免疫原性分析。结果表明，重组乳 球菌对6％NaCl浓度的高盐环境具有较强的耐受能力；可以耐受pH 1．5-4．5的胃液 环境；在人工肠液中出现较明显的生长趋势；但是对浓度为0．1％以上的胆酸盐耐 受力较差(体内胆盐浓度为0．03~o．3％)。因此，在作为口服活疫苗应用时，应 进一步对菌株进行改造，提高菌株的耐胆盐能力，以利于菌株在胃肠道环境中的 生存和释放抗原蛋白。NZ9000／pSEC：LEISS．dcap重组菌培养液口服灌喂 BALB／C小鼠对小鼠的生长发育没有影响，无毒性作用；能够诱发小鼠机体产生 抗Cap蛋白的特异性抗体，血清q丁IgG含量较对照组有显著性差异(Po．02)，能 够刺激肠道粘膜淋巴组织对其产生粘膜免疫反应。因此，作为疫苗制品具有很大 的应用和开发潜力。 ORF3蛋白是新发现的PCV2的非结构蛋白，其功能目前尚不明确。为了对 其功能进行研究，我们分别从三个方面开展工作：首先，采用PCR重叠延伸突 变法对D帕基因进行同义突变，结果使D哟基因的8个稀有密码子替代转化为 叵coli偏爱的密码子，以突变的off3基因构建最c