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酶免疫测定技术 广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇 概述 1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术 2 标记免疫技术的分类： ⑴按标记物分类：同位素标记 荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术 免疫测定技术 酶免疫测定技术 概述： 1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。 2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法 异相法 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法 则需分离后测定 均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术): 2.克隆酶供体免疫测定 ： 酶联免疫吸附试验(ELISA) 第一节ELISA的原理和类型 一、基本要求： 1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。 免疫吸附剂 2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。 酶结合物 3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应。 底物 二、必备试剂： 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag----结合物 酶反应的底物-------底物 三、方法类型： 夹心法 间接法 竞争法 捕获法测IgM抗体 3.竞争法 Ag ※ Ag※Ab + Ab Ag(标本) (定量) AgAb 第二节 ELISA的技术要点 一、试剂制备 ㈠ 免疫吸附剂 ㈡ 酶标记抗原或抗体 二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择 三、操作标准化 一、试剂制备： ㈠ 免疫吸附剂 固相载体 ⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应 ⑵ 载体性能比较 ① 载体材料：+、- 结果差别大 ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。 ⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： ⑴ 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包 被，以消除非特异吸附的干扰。 ㈡ 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2. ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm) 四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黄色) α-萘酚(红色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(红色) 4-氯-1-萘酚(灰蓝色) AP可溶性底物及呈色：