分子生物学实验室技术.pptVIP

DNA的电泳速率由于结合了蛋白质而改变。 电泳可以用来确定DNA、RNA或蛋白质的相对大小，它还可以检测蛋白质和DNA的相互作用。如果一个DNA分子能够与一个蛋白质结合，在电泳过程中，结合物就会明显慢于未结合蛋白质的DNA分子。 这段含有蛋白质结合位点的DNA片段被同位素标记后就能作为探针在聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影后被检测到。 将标记好的探针与可能结合的蛋白质孵育，然后用非变性胶进行分离。如果两者结合，结合物电泳较慢，标记的探针滞后，发生位移。 * * 电泳位移分析。这是在体外检测蛋白质与特殊DNA序列的结合实验，简称EMSA或gel-shift实验。基本原理是如果蛋白质能与DNA片段结合就会改变DNA片段的电泳迁移速率。 将一个蛋白质与同位素标记的带有该蛋白结合序列的DNA片段混合。然后将孵育的混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。没有与蛋白质孵育的DNA片段只有单一的条带。在与蛋白质孵育的混合物中出现两个条带，一条显示的是没有与蛋白结合的迁移率；两一条迁移率明显变慢，说明有蛋白质与DNA片段结合。因此，可以通过电泳位移分析实验来检测蛋白质与DNA的结合。 * 如何更加快捷地确定DNA序列中的蛋白质结合位点？ 蛋白质与DNA结合可以保护DNA不被核酸酶降解或化学修饰。应用这一基本原理，我们可以检测DNA分子上是否结合了蛋白质以及结合在DNA片段的序列。 核酸酶保护足迹法是最常用的技术。 对DNA片段进行末端同位素标记，箭头表示的是Dnase酶切位点，红色圆球表示Lac抑制因子蛋白结合在操纵子上。左侧泳道是Dnase随机切割的DNA的电泳分离图。右侧泳道，DNA先与抑制因子蛋白结合，再用Dnase处理的电泳图。“足迹”在右侧泳道中显示出来，就是特定大小条带的缺失。 * 以上两个检测蛋白质和DNA的结合都是体外实验，在细胞内蛋白质和DNA的结合可以通过染色质免疫共沉淀的方法进行检测。因此，确定蛋白质与特定DNA是否在活细胞存在特定相互作用更有意义。 染色质免疫共沉淀的实验程序如图。向活细胞或组织加入甲醛，使DNA和结合的蛋白质交联在一起。细胞裂解后，将DNA断裂成200-300 bp长的片段。在裂解液中加入B蛋白质的抗体进行孵育，之后通过B蛋白的抗体将所有B蛋白沉淀下来，与B蛋白结合的DNA片段也会一起被沉淀下来。通过解开B蛋白与DNA片段的交联，将DNA片段纯化下来，就可以对沉淀下来的DNA序列进行分析。 最近发展出来的一项非常复杂的分子生物学技术叫3C，是染色体构象捕获分析的简称。染色体在细胞中折叠成立体结构，这种结构不但影响了基因组的稳定、染色体的分离以及基因表达调控等。在染色体上DNA序列之间可以在长距离上发生相互作用。3C就是用来检测DNA长距离相互作用的方法。 * * 如果一个蛋白质是转录激活因子，能够结合到DNA的增强子序列上。增强子序列有的与其调控基因的启动子之间有非常长的距离。在激活基因表达时该序列会结合一些蛋白质将增强子折叠到启动子附近，转录激活因子能将两个DNA区域结合在一起。为了捕捉这种染色体结构，首先用甲醛对染色体片段进行交联。交联后对DNA进行酶切。将酶切后的DNA进行连接。将连接好的产物进行染色质免疫共沉淀。对这种蛋白质特异沉淀的DNA分子进行扩增和序列分析。就能了解到增强子和启动子序列在基因激活过程中是否空间构象发生了变化。 * 这是一个标准的利用质粒载体克隆DNA片段的过程。 通过EcoRI酶切的一个DNA片段插入到质粒载体上获得了重组的质粒，通过转化过程，有的感受态的大肠杆菌摄取了重组质粒。因为质粒载体上含有抗生素抗性基因，这些基因的表达就能使摄取重组质粒的大肠杆菌在含有抗生素的平板上生长，长出菌落。每个菌落就是一个摄取重组质粒的宿主细胞的后代。通过大量扩增这些获得重组质粒的细胞就能获得大量克隆的DNA片段。 还有一些载体不但能够克隆特定DNA片段，还能调控插入基因的表达。这类载体在插入DNA位点上游有一个来源于宿主细胞的有转录能力的启动子，能够调控基因表达。这些质粒称为表达载体。转录使用的启动子来源于宿主细胞。 * 带有插入DNA片段的载体经转化导入宿主细胞才能完成对重组DNA进行扩增。 转化就是宿主细胞从环境摄取DNA的过程。有些细菌不用任何处理就能摄取DNA，被称为遗传感受态。大肠杆菌用钙离子处理后就变成感受态细胞。 摄取了质粒DNA的细胞称为转化子。 * * 用克隆法制备DNA的分子文库是基因组测序和基因克隆的基础。 根据基因组的大小不同，构建DNA文库的难易不同。构建一个病毒基因组的文库很容易，而构建人类基因组的文库就会非常不容易。 构建基因组文库需要将基因组DNA和载体DNA用相同的限制性核酸内切酶来消化，将消化的基因组DNA和载体DNA进行连接。将连接好的产物转化大肠