单克隆抗体电荷异构体分离方法优化-中国医药生物技术.pdfVIP

中国医药生物技术 2014 年 10 月第 9 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2014, Vol. 9, No. 5 385 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.014 ·技术与方法· 单克隆抗体电荷异构体分离方法优化 弢 旻 程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张 ，王 单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一 1 材料与方法 性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构 1.1 材料 体[1] 。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途 1.1.1 单克隆抗体溶液 CHO 细胞发酵液经 Protein A 径，如细胞系及培养工艺[2]，也可能来自于纯化、制剂等制 纯化，低 pH 值孵育，并用 Tris 中和至 pH 5.8 ，浓度约 造过程以及贮存过程的任何阶段[1] 。其中由于抗体分子所带 9.13 mg/ml 。经毛细管等电聚焦电泳测定，酸性异构体 pI = 电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构 7.23，目的组分 pI = 7.34 ，碱性异构体 pI = 7.47 。 体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。电荷异 1.1.2 层析柱 Poros XS 购自美国 Thermo Fisher 构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带； Scientific 公司；Nuvia S 购自美国 Bio-Rad 公司；HiTrap 离子交换色谱图主峰前后出现小峰。由于这些异构体可能会 SP-FF 购自美国 GE health 公司；Eshmuno S、Fractogel-EMD 影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性 SO3-(M)、Fractogel-SE Hicap(M) 均购自德国 Merck 公司； 地识别和分离电荷异构体是至关重要的。基因泰克公司曾对 HPLC-SEC 为美国 Sepax-technologies 公司产品，保护柱为 上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代 Zenix SEC-300 ，50 mm × 7.8 mm，粒径 3 μm ；分析柱为 等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超 300 mm × 7.8 mm ，粒径 3 μm ；HPLC-IEC 为美国 Thermo 过一个 pH 单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学； Fisher Scientific 公司产品，分析柱为 Propac WCX-10 ， ②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除； 250 mm × 4 mm 。 ③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清 1.1.3 试剂 Tris 购自美国 Amresco 公司；NaH PO ·H O、 2 4 2 除[3] 。因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关 Na HPO ·12H O 、NaCl 、HCl 等为国产分析纯试剂；纯水 2 4 2 键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构 由美国 Barnstead 公司超纯水仪制备。 体含量与原研药保持一致。 1.1.4 仪器 ÄKTA