来曲唑通过cAMP—PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP—2和TIMP—2的表达.docVIP

PAGE PAGE 1 来曲唑通过cAMP—PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP—2和TIMP—2的表达 　　[摘要]目的探讨cAMP-PKA信号通路在来曲唑影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2表达中的作用。方法cAMP-PKA信号通路抑制剂H-89（10μmol/L）处理原代培养的人子宫肌瘤细胞30min后，来曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5mol/L）处理24、48和72h。采用实时定量PCR和Westernblot分别检测MMP-2和TIMP-2mRNA和蛋白的表达。结果来曲唑以浓度和时间依赖的方式下调了人子宫肌瘤细胞中MMP-2mRNA和蛋白的表达，上调了TIMP-2mRNA和蛋白的表达（P均0.05）。H-89部分取消了来曲唑诱导的人子宫肌瘤细胞中MMP-2表达的下调和TIMP-2表达的上调（P均0.05）。结论来曲唑通过cAMP-PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2的表达。 　　[关键词]来曲唑；子宫肌瘤细胞；基质金属蛋白酶-2；金属蛋白酶组织抑制因子-2；cAMP-PKA信号通路 　　[中图分类号]R737.33[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2013）16-0004-04 　　子宫肌瘤是育龄期女性最常见的生殖系统良性肿瘤，以月经异常、阴道不规则流血、腹痛、子宫增大和临近器官压迫等为主要临床症状[1]。子宫肌瘤的病因及发病机制十分复杂，目前还没有阐明。目前的研究认为子宫肌瘤是一种依赖于激素的良性肿瘤[2]。芳香化酶是雌激素合成的关键酶，芳香化酶抑制剂可抑制雌激素的合成，降低体内雌激素的水平，从而消除雌激素促进子宫肌瘤生长的作用。来曲唑是人工合成的第3代芳香化酶抑制剂，已被广泛应用于肿瘤领域，其作用机制也不局限于雌激素途径，在许多妇科疾病中都具有良好的应用前景[3，4]。基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）在细胞外基质的降解中发挥着十分重要的作用。基质金属蛋白酶的组织抑制剂-2（tissueinhibitorofmetalloproteinase-2，TIMP-2）能抑制MMP-2的活性[5]。细胞外基质合成与降解之间的失衡在子宫肌瘤的发生和发展中发挥了重要作用。我们以前的研究结果显示来曲唑能缩小子宫肌瘤患者肌瘤的体积，降低肌瘤组织中MMP-2的表达却增加TIMP-2的表达[6]。cAMP-PKA信号通路是调节MMP表达的重要途径[7]。因此本研究旨在探讨cAMP-PKA信号通路在来曲唑下调MMP-2的表达和上调TIMP-2的表达中的作用，为来曲唑在子宫肌瘤的临床应用提供实验依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜（dimethylsulphoxide，DMSO）和来曲唑原药（美国Sigma公司）。小牛血清（杭州四季青），DMEM培养基（美国Invitrogen公司），CO2培养箱（德国Heraeus公司）和流式细胞仪（美国Beckman公司）。ABI7500荧光定量PCR仪及分析软件（美国ABI公司）；GOS7500型凝胶成像分析系统（美国UVP公司）；垂直电泳仪（美国BioRad公司）；转膜系统（美国BioRad公司）。兔抗人α-actin、β-actin、MMP-2和TIMP-2抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗（美国SantaCruz公司），引物由上海生工提供。其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2实验方法 　　1.2.1实验标本采集和细胞培养选择年龄在35～45岁之间的子宫肌瘤患者，术后经病理切片确诊为子宫肌瘤。将手术中切下的子宫肌瘤在无菌条件下取约1cm3的肌瘤组织，PBS清洗肌瘤组织3遍，然后将肌瘤组织剪成碎片，加入含有Ⅰ型胶原酶（800U/mL）的DMEM培养液，在37℃下消化5h。吸取少量消化液滴于玻片上，用倒置显微镜观察。当出现组织块已经消化成分散的小的细胞团或成单个细胞，加入含有小牛血清的DMEM培养液终止消化。收集细胞，制成细胞悬液，用不锈钢网过滤。收集滤液，2000r/min离心10min，吸掉上清，收集细胞。将细胞接种于培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养24h。用显微镜观察细胞生长情况，可见子宫肌瘤细胞贴壁生长。由于子宫肌瘤细胞具有贴壁生长的特性，倒掉培养基并换液而去掉未贴壁的细胞，从而分离子宫肌瘤细胞。当细胞生长达到80%～90%融合度时进行细胞传代。台盼蓝染色后观察细胞活性并进行细胞计数。细胞接种于24孔细胞培养板，细胞密度为5×105个细胞/mL培养基。子宫肌瘤细胞的鉴定方法为免疫细胞化学法，采用抗体为α-actin抗体。呈对数生长且生长状态稳定的细胞用于以后的实验。 　　1.2.2实验分组将子宫肌瘤细胞分为以下实验组：①单独子宫