基因工程与细胞工程.docxVIP

基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性, 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，乂叫做DNA 重幺日牯术 （-）基宙工程的基本工具 “分子手术刀”一一限制性核酸内切酶邙艮制酶） （1） 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2） 功能：能够识别双链DNA分子的某种特上的核营酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核哥酸之间的磷 酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3） 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 “分子缝合针” 一一DNA连接酶 ⑴两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T.f DNA连接酶）的比较： 相同点：都缝合磷酸二酯键。 区别：E?coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而T.DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同： DNA聚合酶只能将单个核昔酸加到已有的核昔酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末 端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶 DNA聚合酶 不同点 连接的DNA 双链 单链 模板 不要模板 要模板 连接的对象 2个DNA片段 单个脱氧核昔酸加到已存在的单链DNA片段上 相同点 作用实质 形成磷酸二酯键 化学本质 蛋白质 3.“分子运输车”一一载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2） 最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体Z外，并具有自我复制能力的双链环 状DNA分子。 （3） 英它载体：入噬菌体的衍生物、动植物病毒 （二）基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法， PCR技术扩增目的基因 （1） PCR的含义：是一项在生物体外复制特定D7A片段的核酸合成技术。 （2） 目的：获取大量的目的基因 （3） 原理：DNA双链复制 （4） 过程：第一步：加热至90?95°CDNA解链为单链； 第二步：冷却到55?60°C,引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70?75°C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5） 特点：指数（2”）形式扩增 第二步：基因表达载体的构建（核心） 目的：使目的基因在受体细胞屮稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因 （1） 启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转 录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。 （2） 终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的 标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞— 转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用 的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1?首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是釆用D\A分子杂交（DNA-DNA）技术。 其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是采用分子杂交（DNA-RXA）技术。 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交技术。 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。 （三）基因工程的应用 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 4.基因诊断：又称为DM诊断，是