第12章 制备型高效液相色谱.pptVIP

待分离成分呈单一主峰 不易分开的两组分 目的组分含量少 第三节 实验条件的选择 色谱柱的选择与填装 柱填料 流动相选择 检测器的选择 仪器设备 一、柱的选择和装填 柱： 不锈钢柱： 200kg ，生物适应性差 玻璃柱：10～15kg 聚合物柱： 装填： 当粒度小于20μm，用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于30μm时；利用轻敲柱外壁的干填法 二、柱填料 硅胶： 葡聚糖和琼脂糖： 高分子聚合物： 颗粒大小 在α很小的分离制备中，要求较高的N值，宜用小粒度的填装柱。 当α很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处。 三、洗脱剂 可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比，离子强度，pH等），将其直接或略加修改后用于制备分离 一般不采用梯度洗脱 选择合适的溶剂溶解样品 采用色谱纯的试剂 四、仪器设备 对泵的精密度和准确度要求不高（ 0.01～100mL/min ） 对检测器的高灵敏要求不高 流路系统尽可能用惰性聚合材料 柱外效应试验结果影响较小 第四节 操作变量的确定 一、样品的进样量 宜注射低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度小体积的样品。 样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。 柱内径，mm 困难的分离（α＜1.2），mg 容易的分离（α＞1.2），mg 2 0.2～2 5～25 8 10～50 100～500 25 100～500 1000～5000 二、制备产率 ·产率随分离度的提高而增加。 ·不过载的柱子，k’值较小时，产率较高。 ·用全孔填料时产率高于用薄壳型的。 ·对于α值小的分离，宜利用小粒度（5～10μm）填料的柱子；在α较大时，使用较大颗粒、大内径的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。 ·柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。 产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。 三、回收率计算和纯度鉴定 除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，冷冻干燥。 纯度：HPLC，TCL。 回收率：重量，活性。 ? 蛇毒中溶栓组分的分离 制备型高效液相色谱的应用 肽的分离 蛋白质的分离 多糖的分离 核酸的分离 肽的分离： 常用方法为反相色谱和离子交换色谱 肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。 反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。 肽的检测：UV200～230nm，荧光检测。 蛋白质的分离 1．填料：孔径300～500 2．流动相 （1）pH 低pH使蛋白质羧基解离受到抑制，极性降低，与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言，使用pH2.5～3.5的流动相可以得到最好的分离。 （2）离子强度和离子对试剂 增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用，较高的离子强度（＞0.2）可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。 缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则复合离子对保留时间减少。 （3）有机溶剂 有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。 使用复合溶剂（如异丙醇-乙醇、乙腈-异丙醇等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。 （4）表面活性剂 两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，使分离得以改善。 （5）温度 为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，分离一般在室温或低温下进行。 三、多糖的分离 分离：高效体积排阻色谱 检测：常用示差折射仪（RI） 示差折射检测器 通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器 凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（10-6~10-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数越为5×10-4，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。 四、核酸与核苷酸的分离 五、脂类的分离 第十二章 制备型高效液相色谱 在生物制药中的应用 基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。 天然产物: 蛋白质,多肽,多糖。 第一节 高效液相色谱法简介 液相色谱的发展史 1903年，色谱法问世俄国植物学家茨维特 1903年3月21日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 1931年，库恩（Kuhn