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Western Blot 基本操作流程 对于小分子量蛋白(100 kD) 1、SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。 2、保持甲醇的浓度在20%。 转膜的注意事项 1、避免直接使用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 2、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 3、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大或过小都会影响转膜效率。 4、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜。 Western Blot 基本操作流程 三、封闭 为什么要封闭？ 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 常用的封闭试剂有1-3%的BSA或者5%的脱脂奶粉，缓冲液一般选择PBST或者TBST。 一般封闭条件为：室温或者37℃1-2hr，特殊情况也可4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液