质粒抽提教学文案.pptVIP

质 粒 DNA 制 备plasmid extraction ;质粒简介; 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术． ;质粒特性;质粒的结构特点;Plasmid vectors;表达载体; ;质粒DNA的提取和纯化 ; 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增;l??? 所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量． ?? 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。 ;二、细菌的收集(bacterial collection);三、细菌裂解;质粒提取的方法;质粒DNA提取方法的选择 ;l选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1．菌株类型（type） 2．质粒的大小(size) 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 (denaturation condition);大质粒（15kb）的处理方法： 采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid损伤减少 小质粒（15kb）的处理方法： 无需特殊处理，碱裂解方法等均可使用 ;四、细菌的裂解和质粒DNA的提取(bacterial and plasmid extraction);细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋 在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中; 1在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。 ?;;;碱裂解法示意图;1~4ml培养细菌收集;碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:(main regeants and components);;碱裂解提取质粒可能存在的问题;在热或碱的条件下时间过长会导致什么结果？ 质粒的超螺旋结构不可逆变性 如：环状DNA不能被限制酶酶切 迁移速率在凝胶中是超螺旋近2倍 Br染色较弱等;（二）煮沸裂解法（boiling）;质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构 通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA;煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌。;（三）SDS裂解法; 由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。;（四）其它方法;1、 小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。 ; （二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。 由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。;质粒DNA的纯化;EB—CsCl密度梯度离心法;;EB—CsCl密度梯度离心法示意图;;;;3 柱层析法;;实验步骤;上清液中加入等体积苯酚/氯仿，振荡混匀，10000~12000r/min离心2min，将上清转移至新离心管中。 加入5mol/LNaCl 150ul，后加入2倍体积无水乙醇，混匀后10000~12000r/min 5min。 去除上清液，加入0.5ml 70%乙醇，8000r/min离心5min，清洗沉淀，干燥。 加入20ulTE，溶解沉淀，1：100稀释后测定浓度。;PCR-单链构型多态性分析;PCR-SSCP;什么是PCR-SSCP？;;;银染原理 ;影响PCR-SSCP的因素