B族链球菌检测的标准操作程序.docVIP

B族链球菌检测的标准操作程序 实验室名称 项 目 编号 制定日期 B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 年 月 日 【目 的】 保证检测结果准确可靠。 【适用范围】 适用于本实验室的检验人员。 【该SOP 变动程序】 本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【试 剂】 试剂名称：B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 生产厂家：北京现代高达生物技术有限责任公司 包装规格：20人份/盒 试剂盒组成： 序号 半成品名称 主要组分 1 DNA提取液 Tris-HCl、NaCH、Triton、EDTA 2 GBS PCR反应液 Tap酶、UNG、引物、探针等 3 GBS阳性对照品 含目标片段的灭火大肠杆菌 4 空白对照品 纯化水 5 说明书 贮藏条件及有效期：试剂盒应置2－8℃ 【仪器设备】 仪器名称： 仪器厂家： 仪器型号： 仪器校准：本仪器由仪器厂家工程师负责校准。 【检验原理】 本试剂盒利用Taqman探针实时PCR技术，针对B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计出特异性引物和探针，配以全封闭PCR体系，检测标本中的B族链球菌DNA。体系中通过加入内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果，并通过加入UNG避免可能的扩增污染物造成的假阳性结果。 【标本要求】 1. 样本采集：采用藻酸钙、普通棉拭子或涤纶拭子采集生殖道或直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本。 （1） 妊娠34-37周孕妇生殖道分泌物：先拭去阴道过多的分泌物，采用无菌拭子插入阴道至内1/3处，沿阴道壁轻轻旋转取得分泌物，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检； （2） 妊娠34-37周孕妇直肠分泌物：将拭子插入肛门，在肛门括约肌以上约2.5cm处，沿肠壁轻轻旋转取得标本，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检； （3） 样本一经送检，则应尽快送至检测实验室，运输应符合当地法规。 2. 标本存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。 样本的冻融次数：实验数据证明，样本冻融6次以内无影响，但应尽量避免冻融。 3. 样本的运输条件：冷冻（干冰运输）4天内无影响，冷藏（冰袋运输）2天内无影响。 4. 含血样本无法正常检测应避免。 5. 研究显示，常用栓剂药物“保妇康栓”会对试剂盒检测造成较大影响，因此取样前应避免该药品的使用。 【检验方法】 1. DNA提取（在样品处理区操作） （1） 妊娠34-37周孕妇生殖道或直肠分泌物：取含有分泌物的生理盐水1ml13000rpm离心10 min，弃上清液，沉淀（如不明显可再重复一遍离心）加无菌生理盐水1ml混匀，13000rpm离心5 min，弃上清。沉淀加入50μl DNA提取液充分混匀，99℃~100℃加热处理10min，13000rpm离心10min，吸取上清至1.5ml离心管中保存，DNA提取完毕。 （2） GBS阳性对照品提取：取50μlGBS阳性对照品加入1.5ml离心管中（用灭菌生理盐水补齐至1ml），13000rpm离心10min，弃上清。沉淀加入50μl DNA提取液充分混匀，99-100℃加热处理10min，13000rpm离心10min，吸取上清至1.5ml离心管中保存，DNA提取完毕。 （3） 空白对照品提取：同GBS阳性对照品提取。 建议： DNA提取完毕后应尽快进行PCR检测，以保证检测效果； 2. GBS PCR反应液配制（在试剂准备区进行） 解冻试剂，在打开盖子之前震荡并短暂离心各试剂管。按标本数量（需包含阴性对照品及GBS阳性对照品）分装GBS PCR反应液。按每管35μl分装至0.2ml PCR反应管/板中，转入样品处理区。 3. 加样（在样品处理区进行） 分装好的各反应管/板分别加入处理好的DNA样品5μl、阴性对照品5μl及阳性对照品各5μl。短暂离心使所有试剂集中到反应管底部（不能有气泡），确定盖好管盖或封膜后，立即进行PCR 扩增反应。 注意：阳性定量参考品含有高浓度的目标DNA，请务必小心操作，避免污染 4. PCR 扩增（在PCR 检测区进行） 按以下方案运行仪器程序： （1） UNG 反应：50℃ 2 min； （2） 预变性： 95℃ 5min； （3） PCR： (95℃ 15sec→60℃ 35sec) 45 个循环；60℃时分别检测FAM 和HEX 通道荧光信号，选择反应体系40 μl。 5. 阈值设定 阈值设定在空白对照正常扩增曲线的上方，基线设定可选择3-5 个循环，一般情况选择为5.00，若是最高浓度样本的Ct 值小于5.00，则在3~5 之间按照低于最高浓度样本Ct 值